转基因小鼠制作技术

日期: 2015年07月30日


    

导读:转基因动物可通过插入目的基因用于过表达基因研究,或是通过插入目的基因的shRNA来降低目的基因的本底表达,也可通过同源重组的方法获得基因Knock-in 和Knock-out小鼠。小鼠作为最优秀的实验动物模型,在转基因动物研究领域也同样得到了广泛验证。本专题详细介绍了转基因小鼠模型建立的标准操作流程。


转基因小鼠简介

广义的转基因动物是指通过实验手段将新的遗传物质导入到动物胚细胞中,并能稳定遗传,由此获得的动物称为转基因动物。转基因动物可通过插入目的基因用于过表达基因研究,或是通过插入目的基因的shRNA来降低目的基因的本底表达,也可通过同源重组的方法获得基因Knock-in 和Knock-out小鼠。

小鼠作为最优秀的实验动物模型,在转基因动物研究领域也同样得到了广泛验证。转基因小鼠的制备技术主要有两类,DNA原核显微注射法和胚胎干细胞囊胚显微注射法。

DNA原核显微注射法

通过显微操作仪将外源基因直接注入受精卵,使外源基因整合到DNA中,发育成转基因动物。此方法是最经典的用于制作转基因动物的方法,也是目前应用最广泛的方法,现在的转基因动物研究大都是在Palmiter等方法的基础上有所改进而进行的。由这种方法制备的动物品种属于狭义的转基因动物的范畴。

由这种方法制备的转基因小鼠其插入目的基因的形式通常是多拷贝首尾相连的形式,其整合到基因组的具体机制目前并没有完全研究清楚。

胚胎干细胞囊胚显微注射法

是在体外将外源基因导入胚胎干细胞;然后将转基因的胚胎干细胞通过显微操作仪注入动物囊胚,此胚胎干细胞可参与宿主的胚胎构成,形成嵌合体,直至达到种系嵌合。胚胎干细胞体外培养时保持未分化状态,当被注入囊胚腔后,可以参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成,因此将外源DNA导入胚胎干细胞就可实现基因的转移。出生的动物其生殖系统就可能整合上外源基因,通过杂交繁育可得到具有纯合目的基因的个体,即转基因动物。目前,胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟,在大动物上应用较晚。基因的敲除及捕获常用这类方法。

转基因小鼠F0的制作

转基因小鼠的制作大致可分为以下几个部分:

1. 用于原核显微注射的DNA的制备:一般是线性化的且经过电泳纯化,凝胶回收,及进一步沉淀纯化,其工作浓度一般为1-5ng/μl。此处DNA的纯度和浓度对后续的成功率影响较大,需谨慎操作。

2. 同步获得供体雌鼠(注射激素的雌鼠与正常雄鼠交配而得)和假孕受体母鼠(正常雌鼠与结扎雄鼠交配产生)。供体鼠用于收集注射用受精卵,而假孕受体母鼠用于孕育注射后存活的受精卵,最后产出F0代转基因小鼠。

3. 供体鼠注射绒毛膜促性腺激素后,采集细胞核清晰的原核受精卵。绒毛膜促性腺激素可使得雌鼠排卵数量是正常排卵数量的2倍。显微注射的受精卵最好于交配后次晨注射前几小时收集,此时易进行注射操作。

4. 用显微注射法将纯化的外源基因注射进受精卵的原核内。工作液中受精卵可能成团状,显微注射用的受精卵必须是单个细胞,而且无细胞碎片。如不符合该标准,需用透明质酸酶进行消化,随后漂洗干净。

5. 受精卵鉴定 ,将存活受精卵或存活胚胎移植到同步交配的假孕母鼠的输卵管(或子宫)内,饲养后鉴定是否受孕以及个体发育状况。

6. 子代鼠外源基因整合和表达的检测。产出的鼠仔中,属转基因小鼠者,约占全部小鼠的20%-30%。因此,对转基因小鼠必须进行鉴定筛选。较常用的鉴定基因是否整合的方法有PCR法及Southern杂交法。而Northern杂交,RT-PCR检测,Western杂交,免疫组织化学法则被用来检测转入基因的蛋白表达状况。

7. 转基因小鼠品系的建立。

以上部分,除了涉及到显微注射外,还设计到多项精细操作,如公鼠结扎,母体内分离获得受精卵,受精卵移植等动物实验。步骤繁琐,实验准备细致,同时还需要具备动物生理,解剖知识以及分子生物学原理和操作知识,短时间内很难建立一个稳定高效的平台。


转基因小鼠的建系与种系保存

DNA原核显微注射方法制作转基因小鼠时,转入的目的基因仅仅只是整合在二倍体动物的其中一条染色体上,所以是半合子,它的后代只有一部分个体带有整合的基因,有的没有目的基因。所以,转基因小鼠需要一个相当长的筛选和纯化过程,以期获得纯合子的转基因小鼠。通常的方法是,制作同一批转基因小鼠后,将其中一的部分与正常的野生型小鼠杂交,检测后代的整合几率,再通过同一窝的阳性雌雄小鼠交配,在基因的同源重组作用下,最终得到纯合子小鼠。

由于目的基因随机整合到基因组,因此首代转基因小鼠将会有不同的整合位点。整合基因的拷贝数可能在不同的首代转基因小鼠中也不同。由于这些原因,每一个首代转基因小鼠需要作为一个独立的谱系对待并且与其它首代转基因小鼠分开来进行繁殖。 每个首代转基因小鼠的子代都需要进行转基因遗传和表达的检测。由于不同的整合位点和拷贝数,每一个首代转基因小鼠可以有不同的表达水平。

一般可采用经典育种与PCR 相结合的方法对转基因小鼠纯合子进行筛选。将用于建系的原代(F0) 转基因小鼠与野生型小鼠配种繁殖产生的后代(不同窝的仔鼠分别统计) 为F1。F1中阳性转基因小鼠同胞交配产生的后代为F2。在F2 中选择数对阳性鼠同胞交配产生的后代为F3。根据各窝鼠的整合率及PCR-Southern 的信号,选出假定纯合小鼠。将假定的纯合子小鼠与野生型小鼠配种产生F4,根据后代整合率,对假定的纯合子转基因小鼠作出验证。可继续传代以求建立稳定的转基因小鼠品系。

通常情况下,制作转基因小鼠,并经过筛选鉴定之后,可以得到纯合子的转基因小鼠,而要对某种转基因小鼠保种,则可以直接用纯合子来保存育种。

但是也有例外:如果目的基因有毒性、致畸或胚胎致死性,则有可能无法得到首代转基因小鼠;或者由于纯合后基因的毒性增加,导致后代健康状况差,丧失生育能力或存活期短等问题,此种情况,纯合子转基因小鼠不适合用作种系保存,我们会用半合子小鼠代替,半合子能减轻这种基因效应,但也因此而带来了筛选工作,这样每次繁殖都需要经过烦杂的筛选。

转基因小鼠的饲养

用于建系和种系保存的转基因小鼠一般饲养于SPF级环境中。

饲养室内的温度保持在22-28℃,相对湿度维持在40%-60%,饲养盒内温度一般比外界环境高1~2℃,湿度高5~10%。昼夜明暗交替时间为12/12;噪音<60dB, ;氨浓度不超过20ppm,换气次数应达到10~20次/小时;饲养室内每天经紫外灯照射两小时杀菌,定期用消毒水进行清洁消毒。

饲料:采用60Coγ射线灭菌的无菌全价营养颗粒料,并可定时喂少量葵花籽。成年转基因鼠采食量一般为3~7克/天,转基因幼鼠一般为1~3克/天,应每周添料3~4次,在鼠笼的料斗内应经常有足够量的新鲜干燥饲料,在转基因小鼠大群饲养中,每周应固定两天添加饲料,其它时间可根据情况随时注意添加。

饮用水:为纯净水装瓶后高压灭菌,每周换水2~3次,成年鼠饮水量一般为4~7ml/天,要保证饮水的连续不断,应常检查瓶塞,防止瓶塞漏水造成动物溺死或饮水管堵塞使小鼠脱水死亡。

垫料:使用经高压灭菌的混合木屑或者玉米芯;鼠笼采用M5型小鼠饲养笼,高压灭菌。鼠笼和垫料每周更换两次。各种操作均在超净工作台内按照无菌操作进行。

日常登记和观察:每天登记各环境数据和小鼠状况,密切观察小鼠饮食、活动及全身情况,若有发现异常状况时需登记检查原因。外观判断小鼠健康的标准是:
①食欲旺盛;
②眼睛有神,反应敏捷;
③体毛光滑,肌肉丰满,活动有力;
④身无伤痕,尾不弯曲,天然孔腔无分泌物,无畸形;
⑤粪便黑色呈麦粒状

即将产崽或刚产崽的的转基因鼠尽量不去打扰,以免刺激到母鼠,可提前加足水和饲料;产崽前可在笼盒内添加一定量的棉絮供其筑窝用。

对于即将运用于实验的转基因小鼠,如无特殊体质缺陷(如营养缺陷型,免疫缺陷型等),可适用普通小鼠的饲养标准。

转基因小鼠模型的建立(SOP)

显微注射法的基本原理和方法

转基因小鼠制备的基本原理是将改建后的目的基因(或基因组片段)用显微注射法注入供体小鼠的受精卵(或着床前胚胎细胞),然后将此受精卵(或着床前胚胎细胞)再植入受体动物的输卵管(或子宫)中,使其发育成携带有外源基因的转基因动物,通过分析转基因和实验小鼠表型的关系,研究揭示外源基因的功能,而且可进行工程动物的大量生产。

Gorden等报道了显微注射法用于转基因小鼠的制备。本法是最早,且应用成功率较高的一种转基因方法。其基本步骤如下:

1.同步获得供体雌鼠(注射激素的雌鼠与正常雄鼠交配而得)和假孕受体母鼠(正常雌鼠与结扎雄鼠交配产生)。

2.供体鼠注射绒毛膜促性腺激素后,采集清晰的原核受精卵。

3. 用显微注射法将纯化的外源基因注射进受精卵的原核内。

4. 受精卵鉴定 ,将存活受精卵或存活胚胎移植到同步交配的假孕母鼠的输卵管(或子宫)内,饲养后鉴定是否受孕以及个体发育状况。

5. 子代鼠外源基因整合和表达的检测。

6. 转基因小鼠品系的建立。

[优点]

(1)外源基因在宿主染色体上的整合率相对较高;
(2)此法导入外源基因无需载体;
(3)转基因小鼠得率在60%-80%;
(4)导入的外源基因可长达50kb。

[不足之处]

(1)外源基因随机整合;
(2)个别原核不清晰,需进行特殊处理;
(3)需大型精密仪器,费用昂贵;
(4)操作周期相对较长。

实验器材的准备

1. 输精管切除术用器材:弯式有齿镊、直式有齿镊、显微镊、手术剪、自动小夹涂药器、自动小夹、带弯针4/0丝线及持针器、直径为10cm塑料 Petri氏培养皿(内盛70%乙醇)。

2. 手术前麻醉:2,2,2 三溴乙醇(阿佛丁)是相当有效的麻醉剂。因该试剂对光敏感,所以应该于4度避光保存,新试剂用前应进行测试。经腹腔注射三溴乙醇麻醉小鼠后,为了使麻醉剂尽快发生作用,将小鼠放回原笼熟悉的环境中,小鼠将会更容易松驰下来。 挤压小鼠脚垫,如果小鼠能感觉到此刺激,小鼠将从挤压部位开始缩腿运动(pedal reflex),用此方法可以检察是否麻醉完全。实验中小鼠无缩腿运动、小鼠达到手术所需的麻醉深度以及程度方可开始手术。

三溴乙醇的反复使用可能引起小鼠腹膜刺激征或者炎症反应。其他麻醉剂中,克他命/甲苯噻嗪在兽医界广泛应用,另外,克他命/美托咪定也越来越受到青睐,特别是在美国。我国一些实验室用戊巴比妥钠的效果好,特别是尾静脉注射控制很方便.30g左右小鼠用0.85%的戊巴比妥钠0.3ml左右。

3. 受精卵的采集用器材:70%乙醇、手术剪、10mL解剖剪、手术镊、M2溶液(Sigma)、小玻璃皿等。

4. 离体输卵管中受精卵收集用器材:二氧化碳孵育箱、眼科镊子、5号镊子、无菌30-mm组织培养皿、解剖显微镜、透明质酸酶、移液管、工作液、M16溶液(Sigma)、3ml注射器等。

5. DNA显微注射用器材
(1) 受精卵的收集与移动用器材:巴氏移液管、酒精灯、特制吸管、玻璃刀等。
(2) 凹玻片准备:一块标准的凹型载玻片(硅化)、矿物油(Sigma)、工作液等。
(3) 注射设备的设置:微型水力驱动设备、Hamilton Gas-Tite™注射器(250 l)、Intramedic™管道系统(外径1.27mm,内径0.86mm)、两只玻璃管道连接头、三通管连接器、一只带接头的60ml塑料注射器、一只器械套管、矿物油等。
(4)受精卵的显微注射用器材:凹玻片(显微注射用)、倒置立体相差显微镜l汉密尔顿注射器)、气压装置(50ml充满气体的注射器)或倒置Nomarski立体光学显微镜、显微操纵器、千分尺(连接添满矿物油,且耐气构造的250 、持卵管、预载DNA的注射针等。

6.输卵管转移的准备
(1) 手术试剂器材:麻醉剂(阿佛丁或可他命/甲苯噻嗪)、70%乙醇、一副钝性齿镊、两副5号精细镊子、一副10cm手术剪、带自动小夹的金属大剪、一个小弹簧夹、外科缝线、解剖显微镜、纤维光学照明器、载针头的1ml注射器、kimwipe绵纸或外科纱布、9cm 塑料皿、工作液、移液管和手动移卵管等。所有的手术器械在使用前应该彻底清洗,70%乙醇消毒或高热灭菌处理。
(2)受体母鼠的准备:输卵管转移的受体鼠应该为4-6周龄大小,体重在20-25克左右,严禁用低体重以及超重母鼠,若体重较低,其体能不足以维持妊娠,可能导致受精卵的重新吸收;若体重较重,麻醉剂被吸收入脂肪组织,降低麻醉效果,可能使手术困难,而且脂肪组织的存在意味着静脉的存在,所以手术时切掉脂肪组织可能导致不必要的出血,难以确认手术时的操作对象。出血也可能堵塞移卵管。选择输卵管转移前一天晚上与切除输精管小鼠交配的假孕母鼠,注射当天早上母鼠可见精栓。尽管像Swiss Webster系的哺育母鼠很容易超重,随着体重的增加,它们将表现出不同程度的感觉消失,但它们是优良的哺育母鼠。另外,它们的价格也便宜。另一个成功的鼠系是B6D2F1,它们生命力强并有一定杂合优势。
(3)麻醉剂:阿佛丁被证明是输卵管转移手术的有效麻醉剂。

实验操作程序和方法

1.鼠系克隆

(1) 动情期的探测:在转基因动物模型的建立中母鼠动情期的监测有很高的技巧性。小鼠的动情期主要划分为四个时期:
① 动情后期:阴道口无扩张,周围组织为灰白色,阴道口周围无膨大
② 间情期:阴道开口小,周围组织为灰色或蓝色
③ 动情前期:阴道口逐渐扩张,阴道周围组织由粉红色变为红色。
④ 动情期:阴道周围组织颜色由红色转为粉红色,阴道口背侧唇可见条纹,阴道口腹侧唇可见肿大,阴道有分泌液外渗。
随机选择动物,任何时间都可能有20%-25%的动物处于动情期。大多鼠科动物的动情期平均持续4-5天,所以对群居性动物的个体进行动情周期的同步化处理后可能在任一时期产生大量发情动物。动情期动物的选择需两个指标:阴道周围组织色泽和组织膨胀的程度。动情期动物阴道组织深粉红色,但并不同于炎症时的色泽。另外,阴道口周围背腹部组织肿胀而有光泽,起初其腹部可见条纹。个别阴道口组织色泽较深,但无膨胀,或阴道口稍微扩大且略带灰色者为非动情期动物,切勿误选它们用于交配。
(2)交配的确认:阴栓形成。动物合笼后,确定雄性个体是否与母鼠成功交配非常有必要。由于雄性精液可在阴道内凝固成柔软栓性物,成功交配后不久有阴道栓形成。以手的中指、小指和拇指捏住雌性尾根处,使小鼠头部向下,仔细观察阴道口部位,交配过的雌性小鼠可见有白色橡皮擦状的阴道栓,易肉眼所见,难以确定时可用小探针检查阴道深部是否有栓子存在。检查阴栓应在每天早上的早些时间,因为随着时间的推移,阴栓将被排出体外。

2.输精管切除术:输精管切除小鼠用于与晶胚转移母鼠交配使母鼠假孕。小鼠6-8周龄进行输精管切除术,CD-1 B6D2F1(C57BL6 *DBA/2)或Swiss Webster系是通常的实验对象。阿佛丁腹腔注射麻醉剂量为240mg/kg。

(1) 称重后麻醉小鼠,背位固定小鼠,大剪刀贴近皮肤剪毛,70%的乙醇涂 搽消毒手术切口部位,以防止毛发污染切口。
(2) 于生殖器前方大约1.3cm处横行剪开下腹部皮肤,作约1cm的切口, 用浸70%乙醇的纱布搽拭切口部位以清理毛发。
(3) 切开腹膜,进行膀胱定位。每侧都可见有一条管道走行,用镊子轻轻夹持左侧管道,提起部分使手术视野清晰可见,确定其为输精管。
(4) 将镊子插进输精管下方,使它们处于自然状态,其末端垂直。同时在该位置两端用缝线结扎输精管,距离大约4-5毫米。在两结扎点间剪断输精管,置其于纱布上确定此侧手术完毕。
(5) 将输精管两个断端轻轻放回腹腔,如上处理右侧输精管。两侧手术完毕后,2-3根单独缝线缝合腹壁切口。待用缝线须浸泡在70%乙醇中,保持缝线湿润,防止结扎时粘附组织。用两个或三个自动小夹夹闭皮肤。
(6) 为保暖包裹小鼠于纱布中或将其放置于热垫内使其苏醒,处于麻醉状态下的小鼠应该严格监护直到其完全苏醒。手术后小鼠饲养2周后确定手术是否成功。
(7) 实验性饲养:将1-2只母鼠与输精管切除小鼠合笼饲养,次晨进行阴道栓检查。有阴道栓的母鼠,用磷酸缓冲液处理后24小时,其输卵管潮红。卵细胞应该处于单细胞期或未受孕状态,若处于双细胞期,则输精管切除未完全,雄性小鼠应进行再筛选。

3.受精卵的收集

(1)受精卵的采集:受精卵获得的方法分自然排卵和激素诱发排卵以及体外受精三种方法。本章对诱发排卵法给予介绍。
诱发排卵法:雌性小鼠生后6—8周达到性成熟,性周期均为4—5 日,其排卵时间可用饲养室的明亮和黑暗进行调节,所以必须对饲养室的明暗规律进行准确严格地管理。
性周期是卵泡刺激素和黄体生成素相互作用的结果,我们可以从外部给予这些激素诱发排卵。向成熟雌小鼠腹腔内注射5国际单位(IU)的孕马血清促性腺激素(PMSG)之后,约在48—54h后再将2.5-5.0 IU的人绒毛膜促性腺激素(hCG)注射于同一小鼠腹腔内,约12h后即可诱发排卵。排卵数量可达自然排卵的2倍,效果很好。雌小鼠给予hCG后应立刻与雄性合笼。成熟雄小鼠应按每笼饲养1只,雄性小鼠大小在12周龄到1年。合笼时,须将激素化雌性小鼠放进雄小鼠的笼中。雄小鼠释放促雌性发情的外激素,在交配过程中建议不换笼,交配过的雄小鼠,间隔一周后才进行下次交配。
显微注射的受精卵最好于交配后次晨注射前几小时收集,此时易进行注射操作。交配后过夜小鼠的阴道栓易见,可用交配指示剂指示。对超排卵的交配母鼠体内进行阴道栓计数一般正常。低比率的有栓母鼠说明促性腺激素失去效力或雄性小鼠交配过度或雄性小鼠老龄化。收获受精卵必须打开小鼠腹腔,输卵管必须仔细切开。输卵管冲洗术或输卵管壶部切开术都可作为收集受精卵的方法。

(2)腹腔内输卵管的切开
1) 通过断颈或二氧化碳吸入快速处死小鼠。
2) 将动物背位固定在无菌干燥的吸水纸上,剪毛并用70%的乙醇彻底涂搽手术部位。以避免毛发污染手术视野。
3) 持眼科镊捏紧下腹部正中线皮肤,用外科剪作小的横切口,剪刀钝性分离充分暴露手术视野,或钝性撕开皮肤暴露腹膜。用眼科剪打开腹膜,充分暴露腹腔与子宫角部手术视野。子宫为Y形,为起自盆腔膀胱后的肌性器官,向上分支为两侧子宫角,向上横行深入腹腔。
4) 用镊子距输卵管卵巢6-7mm处夹持子宫角翻转后轻轻拖出腹腔,在镊子捏点下部子宫角下方附近刺破肠系膜,清除肠系膜组织远离子宫角与输卵管,并防止用力过大压破子宫角与输卵管连接处。
5) 用镊子拖出脂肪垫,卵巢,输卵管以及子宫部件。小心剪掉卵巢与输卵管之间的薄层膜,然后剪下输卵管和部分子宫角,将其盛放在盛工作液的小玻璃皿中,对另一侧输卵管重复上面操作,完毕后如上处理下一只动物。

(3)离体输卵管内受精卵的收集:解剖镜下观察近输卵管漏斗部上部明显潮红此为壶腹部。用眼科镊子撕开膨大的壶腹部即看到包绕受精卵的丘细胞团。
1)转移输卵管于含工作液的小玻璃皿中。
2)眼科镊子夹持壶腹部,并用另一只眼科镊子撕开膨大的输卵管,游离的受精卵慢慢流出,也可以用镊子轻轻挤压输卵管将受精卵推出裂口。

(4)透明质酸酶处理与受精卵的漂洗
工作液中受精卵可能成团状,微注射用的受精卵必须是单个细胞,而且无细胞碎片。漂洗细胞时,首先用工作液除去细胞碎片。不成团细胞可用无菌移液管收集到盛工作液的玻璃小皿中,注意把握移液管的张力。溶解在工作液中的透明质酸酶对细胞团以及复合体进行消化时必须严密观察,一旦细胞团溶解立即将单细胞转移到新鲜工作液中,防止消化过度。
C, 5%用工作液漂洗2-3次,清除碎片后,用无菌移液管将受精卵置于特殊培养基(M16),放于37 CO2孵箱中待注射,此培养基上层覆盖高压消毒矿物油,可防止污染同时防止培养基水分蒸发影响pH。受精卵在体外发育较体内快,在孵育过程中注意观察一些受精卵清晰可见原核形成,在此期间可先选出原核清晰的卵(形态稍不规则)用于注射,其它卵继续培养。注射后,再筛选,再注射,直至得到满意的注射卵数。

4.显微注射

(1)导入DNA的制备:显微注射首先涉及导入DNA的制备,显微注射的转入基因通常为去除载体序列的线状DNA,转基因所用载体是真核表达载体,即含有在哺乳动物细胞内表达的真核启动子。所谓组织特异性的实现多是通过组织特异性启动子来实现组织特异性表达的。制备转基因小鼠,必须对待导入DNA进行分离纯化。实验必须用经过琼脂糖电泳鉴定并确定其纯度的DNA,对导入基因的大小没有特别的限制,长链DNA也可成功。 实验中注意防止一些杂质堵塞注射针,如琼脂糖颗粒、纤维物质等,需尽量超速离心除去。
DNA的注射质量是实验成功的关键。研究表明DNA注射的起始浓度大约在1ng/ml,当DNA注射浓度超过一定上限时,实验效果不佳,而且大于5 ng/ml会产生明显的毒性作用。
导入DNA的制备程序如下:
1) 通过在Tris/acetate/EDTA缓冲液中进行琼脂糖凝胶电泳从载体中分离待插入DNA,用5mg/ml溴乙啶染色。
2) 为防止对插入DNA的溴乙啶的破坏,用长波紫外光显影。
3) 切下目的基因所在凝胶片,电泳制备目的DNA,或用Qiaex凝胶抽提试剂盒进行抽提。
4) 乙醇沉淀目的DNA。在样品中加入1/10体积的3M乙酸钠,混匀,再加入2-2.5倍体积无菌100%乙醇进行沉淀。
5) -200C 孵育过夜后,超速离心机10000转/分,离心5分,收集沉淀,重悬沉淀于Elutip缓冲液。
6) 用Elutip-D微型柱对目的DNA过柱处理。
7) 按照步骤4重新沉淀DNA,用70%乙醇漂洗沉淀2-3次,真空干燥沉淀。清洗与干燥过程极其重要,因为残余的盐和乙醇对受精卵的发育是致命的。
8) 注射缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl/0.1 mmol/L EDTA, pH 7.5)重悬沉淀,缓冲液必须是Milli-Q纯化水配制
9) 通过荧光光度计或凝胶电泳比色法评估目的DNA的浓度l.μ
10) 用注射缓冲液调整目的DNA的浓度在5-10ng/

(2) 器械准备

[注射针的制作]
注射针是内含玻璃细丝的薄壁毛细吸管,它可以通过毛细管虹吸作用进行载样。用拉针仪(SUTTER,P2000 laser based micropipette puller,具体操作程序详见产品说明书)可以把注射针水平或垂直扯下来。必须保证制备的毛细管可以进入拉针仪这样加热组件大约在毛细管的中央位置。一般用内径为1.0mm的微电极管为材料制作注射针,微电极管可以买到,它与拉针仪是匹配的。另外,应该对拉针仪的设置进行选择,使细丝温度和扯拉力度(主拉力和次拉力)将处于最佳状态。具体需要预实验来确定其最佳设置。待用注射针应该用蒸馏水严格清洗以除去残留炭化物颗粒。严格的实验微电极管在使用前应经过泡酸、泡蒸馏水和硅化的程序,但有人省略了此步也有较好的结果,经拉针仪拉针后就没法清洗,好的拉针仪是不会残留炭化物颗粒,若拉成后清洗其针尖很容易断掉,可用Narishige Japan model PN-30。

[持卵管制作]
m左右,内径要能吸住受精卵,而又不把卵吸入管内。为便于操作,持卵管可进一步调整使其末端轻微弯曲(15度)。m。持卵管的内径很重要,可用铂金灯丝灼烧管口,使其内径为30-50为避免机械损伤,持卵管口应该是钝性末端而且其孔隙有限,使受精卵轻轻依附在负压管道中。这种高度密实可抵抗密封系统的破损,而密封可以减少受精卵注射时的旋转运动。持卵管的口部应该光滑,平整及与其长轴垂直。具体制备操作:双手执毛细玻璃管的两端,将管的中部置酒精灯外焰烧红至变软后离开火焰,同时双手外伸,将烧软的部分拉细。用玻璃刀或细沙轮小心将细管切开,在镜下观察切口应平齐(如不平齐,应重新切割)。然后于酒精灯火焰底部的蓝焰边缘处将切口钝化处理(即将管口于蓝焰边缘处做短暂灼烧,然后于显微镜下检查管口形状,如此反复,直至满意)。如实验室配有持卵管制作仪,则可在显微镜下直接监视热灯丝对持卵管管口灼烧后的形状,及时调整二者之间的相对位置,更易得到满意的持卵管。持卵管应该做调整,用熔断仪将其打弯使其末端成15度(不同的显微注射仪度数可能有差异,打弯成25度左右,一般为20-25度)轻微弯曲以方便使用。此持卵管为不含细丝的玻璃,显微镜下用含刻度目镜确定持卵管的外径应该为100-140

[洗卵管制作]
1) 点燃酒精灯,调节火焰到最佳。捏持玻璃毛细吸管或巴氏移液管在火焰上焰旋转过火。
2) l的吸管。注意制备过程中离开火焰的时间以及扯拉的力度,尽量保证制备吸管的一致性。当吸管开始变软,快速撤离火焰,向外急剧扯拉使吸管变长,形成口径大约200
3) 为吸管评分,轻柔地折断吸管,辨别其声音是否清脆,或扯拉吸管或只做弯曲直到两根同分数的吸管断裂为止。
4) 解剖镜下(要在熔断仪上)检查吸管,并对其进行调整,确定其口径以及管口光滑平整。

[移卵管的制作]
用于转移注射后受精卵到假孕鼠体内的吸管制作过程同上洗卵管。不同的是,这些吸管的口径稍微小一些,大约150 m(150-160m),直径比单受精卵的口径略大一些,将促使卵细胞精细的充满移卵管并转移到输卵管。移卵管在打磨过程中要求管口更光滑平整以减轻插入输卵管时对输卵管的损伤,同时必须注意移卵管头在火焰上时间不可太长,防止融化堵塞。管口要平且要钝化。

[凹玻片的准备]
必须准备适合承载用于微注射的受精卵的凹玻片做微注射槽,也可用培养皿做注射槽,载玻片上的受精卵应该浸润在pH缓冲工作液中,如M2溶液,使受精卵在孵箱外保持30-40分能受到保护。具体凹玻片的准备程序如下:
1) 在超净台内利用手动移液器将M2溶液加入凹玻片窝的基底部形成直径大约0.6cm液面,液滴的液面要水平平整,避免液体的折射效应。吸取胚胎实验用矿物油于M2溶液上,矿物油的量以刚刚达M2溶液最高液面为宜,将凹玻片置于倒置显微镜的载物台上,在低倍镜下调节焦距,使M2溶液液滴的底面清楚为止。
2) 覆盖矿物油的作用:防止液滴脱水以及浓缩;使受精卵处于无菌状态;固定M2溶液液滴。
3) 从孵箱中取出受精卵,用移卵管吸出受精卵并用M2溶液洗涤2-3次,调整实验用量,将其置于凹玻片的M2溶液中,调焦使在低倍镜下清楚地看到受精卵的轮廓,并且保证受精卵有足够空间自由移动,用持卵器将卵汇聚到一起,移卵时注意不要将气泡移入,影响操作视野。

[显微注射设备]
显微注射仪的基本工作原理是运用立体倒置相差显微镜进行观察监测,显微镜两侧各置一台显微操作仪,一侧接持卵管,另一侧接注射针,可调节持卵管或注射针的空间位置。持卵管通过塑料管连接一个装满矿物油的带微调的注射器,通过调节压力控制卵的运动。注射针通过塑料管连接有压力泵的注射仪。将注射时间与压力固定后,进行注射操作。操作系统有LEICA AS TP基因转殖操作系统(major instruments.co.Ltd)等,具体操作程序按其说明书严格进行。

(3)注射针内DNA的装载
把注射针的钝性头浸在盛待注射DNA的管中,溶液通过毛细吸管的虹吸作用进入注射针。注射针的末端应该一直留在DNA溶液中直到注射针末端有小泡形成。这说明DNA溶液装载完毕。仔细检查注射针针头末端,距其几毫米处可见一个小凹液面。最后可将载满DNA溶液的吸管装在持针器或固定在器械环中待用。

(4)受精卵的显微注射

受精卵的显微注射过程相对简单,制作大量样品过程中,为保证显微注射量的一致性,必须通过大量反复有效的练习才可以成功。
1) 置凹玻片于显微镜下,低倍聚焦。
2) 调节持卵管,注射针与受精卵在同一视野下后,转换到高倍镜(32X)下时位置稍微低于受精卵,以便自如地操作受精卵。
3) 挨近注射针到工作液或油界边缘,稍微进入油界。在注射前,增加注射针的压力可见DNA溶液泡在油内形成囊状,以此确定DNA溶液流存在。
4) 如果未见DNA溶液流,则轻轻摩擦持样器钝缘,渐渐的打开注射器针头。针头重新进入油内确定DNA溶液流的存在。
5) 移动持卵管回到受精卵下部。通过微分驱动水压控制系统使持卵管内产生温和的负压,并使持卵管末端吸住受精卵。此操作必须确保受精卵基底部与凹玻片基底部轻轻接触。注意不宜吸得过紧,否则会使卵变形,甚至会将卵吸人持卵器内。
6) 对持卵管内真空进行缓慢调节,使持卵管内受精卵轻柔地旋转,使卵内原核位于持卵管口的远侧端。
7) 维持持卵管稳定,使注射针的针头紧靠受精卵的透明带,进行调节并使针与原核处于同一平面上。用注射针依次刺破透明带,细胞外膜,前核核膜,进入核膜内,受精卵的透明带易被针尖刺破,前核核膜相当有弹性,应用不同的方法进行尝试突破此结构。操作时避免与核接触损伤核仁。
8) 保持注射针位置固定,轻轻增加压力使DNA溶液流入前核中。注射过程中可能出现的现象如下:

① 注射后原核将膨大到原来的两倍左右,表明注射成功,然后直接抽出注射针。
② 一气泡出现在注射针尖端,透明带可能膨胀,表明受精卵的膜非常艰固,没有被刺破,此时需继续向内进针,直到尖端进入核,同时要小心注射针尖端极易破损。
③ 注射针压力较大,看不到任何现象,可能是注射针堵塞,需换针或更换DNA溶液。
④ 若见胞质颗粒涌出到卵黄周围空间,说明受精卵破裂。注射过程中,发现卵破裂数目较多,则需更换注射针。一支注射针一般可注射5—10枚卵。

9) 用持卵器移动受精卵到凹玻片凹内相对隔离的位置,以区分注射组与非注射组。重新安装持卵管并进行下一组操作。

5.受精卵的输卵管转移

(1)受精卵的输卵管注射

1)将麻醉小鼠放置于一塑料平皿盖上,固定小鼠牙齿于皿缘以确保小鼠气道通畅。用70%乙醇涂搽切口部位。也可预先在手术部位剔除毛发。
2)将受精卵从培养液转移至工作液内。因受精卵在转移过程中在孵箱外操作,所以应该将其从培养基中移到工作液中。
4) 用移卵管装载受精卵。移卵管的正确装载对输卵管转移的成功非常重要。如图11-1所示,吸取一定量的工作液在移卵管尖端,然后吸取些许空气制成一个小气泡。再吸取与气泡体积大约相当的工作液,紧接着在吸取另外一个小气泡。收集受精卵于尽可能小容积的工作液中,将其线形排列于移卵管中。当所有的卵被负载后,再吸取小量气体制成小气泡,接着吸取最终容量的工作液。气泡将有利于对压力进行调节,更容易使卵移动。
5) 手术暴露输卵管复合体。如图所示,在离中线约0.5厘米、背驼峰与后腿髋关节之间作横行切口。仔细用浸70%乙醇涂搽切口部位,并搽去毛发。捏住一侧切口皮肤,钝性分离皮下组织。移动皮肤直到腹壁神经走行清晰可见。这时可看到腹壁下红色卵巢或浅色卵巢脂肪垫。用眼科镊捏住腹壁,并作约0.5厘米横行切口,钝性分离组织,轻轻移出脂肪垫、卵巢、输卵管以及子宫。用弹簧夹夹住脂肪垫并保持子宫在适当位置。若子宫及子宫角频繁滑回腹腔,在保证气道通畅的前提下,可适当重新布置其位置。
6) 轻轻移动塑料平皿,使小鼠位于解剖显微镜下,适当调节显微镜及小鼠位置使其输卵管卷曲部清晰可见。
7) 用眼科镊于漏斗部透明囊膜处钝性撕开小口,并防止撕裂血管,引起出血。必要是撕裂口部位局部应用肾上腺素以减少出血,并用纱布擦拭保持操作视野干净。
8) 一旦漏斗部清晰可见,用镊子夹持其边缘并充分暴露漏斗管口。在避免壶腹损伤的前提下,尽可能插入移卵管。
9) 在压力可调节的前提下,轻轻把卵吸吹进入漏斗部。气泡可以阻止卵回流而且很容易使卵进入输卵管漏斗管。若吹卵的压力太大,那么移卵管口可能抵在输卵管壁上,这时可稍微后撤移卵管再进行操作,也可能由于血块堵塞移卵管,若这样,则应该吹出细胞在培养皿中,重新吸卵。
10) 移卵操作完成后,撤回移卵管,去除器械,按原本位置将各器官重置于腹腔内。
10)缝合切口,用小夹夹持皮肤。常用自动小夹代替缝线,这样可以避免小鼠啃嘶缝线,切口裂开。
11)若进行双侧手术,则于另一侧子宫角重复上述操作。
12)手术完成后,安置小鼠于清洁的笼中。麻醉状态下,小型哺乳动物无法有效维持机体温度。所以应该注意小鼠的保温。可以用热垫保持其温度直到动物苏醒。所有的动物在回笼前20-30分可苏醒。由于妊娠很容易使受体母鼠产生应激反应导致流产或食子,所以对受体母鼠必须严格监护。

(2)注射后期监护:手术后严格监护防止并发症的发生非常重要。麻醉易诱导小鼠出现血压升高,所以手术后必须严密监护至少2小时,同时推荐进行保温处理。

处于麻醉状态的小鼠应该用软纱布包裹,而且笼中加垫草垫以及软材料,并保持鼠笼温度。正常体温的维持可以缩短动物处于麻醉状态的时间。

手术后小鼠常规4-5天观察一次以确保小鼠处于恢复中,清醒小鼠应活动自如。腹腔手术后小鼠有发生肠疝的可能。所以手术时保持切口尽量小,缝合严密,而组织胶水的正确应用可以避免此类并发症的发生。皮肤必须用缝线或不锈刚夹夹闭,手术后1-2周可拔除。如果动物状态不良,表现厌食,脱水,或明显弓背,通过动物饮水可给予羟苯基乙酰胺以及同类止疼药。若发生脱水,可腹腔注射0.9%生理盐水或林格氏液。若仍无改善可在麻醉状态下重新打开手切口确认是否有疝发生。若动物状态无明显好转,最终采用安乐死进行。

转基因小鼠的鉴定

产出的鼠仔中,属转基因小鼠者,约占全部仔小鼠的20%-30%。因此,对转基因小鼠必须进行鉴定筛选。

1. 转基因整合检测

鉴定转基因小鼠最简单的方法是从小鼠尾尖提取基因组DNA,检测其基因型。检测方法包括PCR和Shouthern 杂交。

(1) 基因组DNA的提取:
1) 将离乳期小鼠(>4周龄)麻醉标记。
2) 用一只手抓住小鼠,另一只手持消毒剪剪下约1cm的鼠尾。
3) 将剪下的鼠尾放入500 l消化缓冲液中(50mmol/L Tris-HCl, pH8.0; 100mmol/LEDTA; 100mmol/LNaCl; 1%SDS), 并加入蛋白酶K使其终浓度为100 g/ml,550摄氏度下震荡孵育3~4 小时或过夜孵育。
4)加入5 l RNA酶A,370C孵育1~2小时。
5)DNA的分离纯化步骤参见第一章的第三节。

(2) PCR检测: 转基因的初始筛选通常采用PCR检测技术。该技术操作简便、快速、费用低而有效,适合大量标本的分析。由于该技术特别敏感,可能产生假阳性结果。因此,在操作过程中必须特别小心,避免质粒DNA或其它标本的基因组DNA的污染。假阳性的产生对转基因小鼠的筛选工作将是致命的。PCR实验应采用双复管,甚至三复管。阳性结果最好用Southern杂交技术进一步证实。 PCR的实验操作参见第一章的第六节。

(3) Southern blot分析:该技术虽然没有PCR技术那样敏感,且费力费时,但是避免了因污染导致假阳性结果的麻烦,可以得到目的基因整合后的基因组、整合位点数目、转基因拷贝数等的确切信息。Southern blot的实验操作参见第一章的第八节。

2. 转基因表达检测

转基因整合检测是确定目的基因是否整合到了小鼠的基因组中,同时可确定整合的位点和拷贝数,这在遗传学上是十分重要的。而转基因表达检测是确定目的基因在转基因小鼠器官组织中表达的时空分布。其检测包括RNA分析技术和蛋白质检测技术。
(1) RNA的分离:根据实验者的需要从转基因小鼠组织或细胞中提取总RNA或mRNA。分离总RNA比较简单,且适合做基因做基因转录分析。实验操作参见第一章的第四节。
(2) Northern 印迹分析:该技术用于定性检测转基因动物组织或细胞中转基因转录的相对水平。其实验操作参见第一章的第九节。
(3) RT-PCR检测:该技术可定量或半定量检测转基因小鼠组织或细胞中转基因特异表达的mRNA,且非常敏感,Northern 印迹未能检测到的转录子,该技术亦可检测到,甚至可测出1000个细胞中的一个拷贝的转录子。其实验操作参见第三章第一、二节。
(4) Western 印迹分析:该技术通常用于转基因小鼠组织或细胞中转基因编码蛋白的表达水平。其实验操作参见第一章第十节。
(5) 免疫组织化学分析:该法可检测转基因编码蛋白表达在转基因小鼠中的组织分布。有多种实验方法,可参看相关的免疫学检测技术书籍。

附录:特殊实验溶液的配制

1. M16溶液:
称取 0.5534 g NaCl,0.0356 g KCl,0.0162 g KH2PO4,0.0294 g MgSO4•7H2O, 0.0252 g CaCl2•2H2O,0.32 ml乳酸钠(60% 糖浆),0.0036 g丙酮酸钠, 0.1000 g D-葡萄糖,0.0010 g酚红,0.2106 g NaHCO3。溶于100ml超纯水,0.22 m滤膜过滤除菌,分装后40摄氏度储存不超过3周,加入4 mg/mL BSA可立即使用。
2. M2 溶液:
称取0.5534 g NaCl, 0.0356 g KCl, 0.0162 g KH2PO4, 0.0294 g MgSO4•7H2O,0.0252 g CaCl2•2H2O,0.32 ml 乳酸钠(60% 糖浆), 0.0036 g丙酮酸钠, 0.1000 g mD-葡萄糖,0.0010g酚红 0.0337g NaHCO3, 0.5000g HEPES。定容于100ml超纯水,0.22 滤膜过滤除菌,分装后40C储存不超过3周。M2用于孵箱外卵的操作,用HEPES调节pH,加入4 mg/m BSA可立即使用。
3.工作液:
无丙酮酸钠的高糖(4500 mg/mL)DMEM。具体配制见说明书
4.注射缓冲液:
10 mmol/L Tris-HCl/0.1 mmol/L EDTA, 调节pH 为7.5.

本文转自生物探索,如有侵权请联系删除。

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