LIF(白血病抑制因子)的前世今生

日期: 2015年07月31日


    

导读:LIF的英文全称为Leukemia Inhibitory Factor,中文译为白血病抑制因子,其为一种具有多种功能的细胞因子,但其最重要的应用是维持小鼠胚胎干细胞的未分化状态。为帮助您更好的选择和使用LIF,特与大家分享此文。


LIF是如何发现的

LIF从发现、克隆到2013年已经有25年的历史了。那么LIF是如何被发现的呢?这要从白血病的治疗说起。

我们知道,正常的血液细胞是终末分化的细胞。存在于骨髓或外周血等处的微量造血干/祖细胞经过增殖和分化后可成为成熟的血液细胞,以不断补充死去的成熟血液细胞。如果造血干/祖细胞的增殖、分化过程受到异常调节,这些细胞将停留在幼稚的细胞阶段,而数目仍在不断增加,这就是白血病的成因。因此,白血病是造血细胞的增殖和分化过程失去正常的控制而形成的。科学家一直在寻找能够促进白血病细胞分化,同时又能抑制其增殖的细胞因子或药物,以期治疗白血病[1]。

19世纪80年代已发现了一些调节造血细胞增殖和分化的细胞因子,如G-CSF(粒细胞集落刺激因子)、M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)、GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子),Multi-CSF(即现在的IL-3)和IFN-γ(干扰素-γ)等。这些细胞因子的共同特点是:既能促进造血细胞的分化,又能刺激它们的增殖。这就带来一个问题,即这些细胞因子在促进白血病细胞分化的同时,也会大量增加白血病细胞的数量,这样可能会加重白血病的病情,而不是治疗白血病。所以,科学家试图仍然需要找到一种只诱导白血病细胞分化,但不促进白血病细胞增殖的细胞因子来治疗白血病。



1969年在从SL品系小鼠的自发髓系白血病体外建系(即后来我们所熟知的小鼠M1髓系白血病细胞系,常用于重组LIF蛋白的生物活性检测)的过程中,研究人员发现,正常细胞的培养液可诱导M1白血病细胞系分化为成熟的巨噬细胞或粒细胞。研究人员将培养液中的这些未知的诱导成分统称为Differentiation Stimulating Factor,即分化刺激因子,简称D-factors (D-因子)[2]。

1981年[3]年和1984年[4]科学家分别从小鼠Krebs肉瘤细胞和小鼠 L929成纤维细胞的培养液中鉴定出MGI-2(Macrophage and Granulocyte Inducing-2,巨噬细胞和粒细胞诱导-2)和一种D-因子,两者均可诱导小鼠M1髓系白血病细胞的分化,而不刺激正常造血细胞的增殖。

紧接着在1987年,澳大利亚皇家墨尔本医院沃尔特与伊丽莎医学研究所(Walter and Eliza Hall Institute (WEHI), Royal Melbourne Hospital)的Donald Metcalf实验室从小鼠Krebs肉瘤细胞培养液中分离出可以诱导小鼠M1髓系白血病细胞分化的蛋白,因该蛋白具有抑制M1髓系白血病细胞增殖的作用,因而被命名为白血病抑制因子,即Leukemia Inhibitory Factor (LIF)。同时发现,该蛋白不能刺激正常髓系前体细胞的增殖。 Donald Metcalf等认为LIF与前面所发现的MGI-2和D-因子是同一种物质,因他们最大的共同点是均可诱导小鼠M1髓系白血病细胞向巨噬细胞分化。至此,LIF蛋白被正式发现和命名,MIG-2和D-因子为其别名。随后,Donald Metcalf实验室分别于1987年和1988年克隆出表达小鼠LIF和人LIF的基因[5,6]。

LIF的发现似乎给人们治疗白血病带来希望。然而深入的研究发现,LIF的作用非常广泛,即使对于白血病细胞系,也是有些抑制,有些促进。因此,LIF与其它多功能的细胞因子,如TNF-等相似,很难应用于临床。这些年来,LIF颇受关注。血液学家、神经生物学家、肌肉细胞生物学家、骨生物学家、内分泌生物学家和生殖生物学家都在研究LIF,可惜没人能够做深[7]。LIF目前最广泛的应用还是在实验室里用来培养小鼠胚胎干细胞,这在后面会详述。


LIF怎么和小鼠胚胎干细胞的培养联系上的呢?

LIF因为可抑制小鼠M1白血病细胞的增殖而得名,那么科学家又是如何发现其在mES培养中的重要作用呢?科研充满了巧合,但需要敏锐和发散性的思维去感触这种巧合。

1981年剑桥大学的Martin Evans,Matthew Kaufman和美国加州大学旧金山分校(UCSF)的Gail Martin等首先从小鼠胚胎内细胞团(Inner Cell Mass, ICM)中获得小鼠胚胎干细胞(mES)[8,9]的时候,必须在饲养层细胞(feeder cells)上进行培养,否则mES就会自发分化。

为分析饲养层细胞抑制mES分化的机制,人们从饲养层细胞的培养上清中分离出能够抑制mES分化的成分[10,11]。但这些成分的抑制分化作用均弱于英国爱丁堡大学医学院(University of Edinburgh Medical School)的Austin Smith于1986年从Buffalo大鼠肝脏细胞培养上清中分离出来的DIA(differentiation-inhibiting activity),即分化抑制活性蛋白[12]。后来,Austin Smith转到英国牛津大学工作,并继续研究DIA。1988年与美国Genetics Institute公司合作,Austin Smith在探讨DIA是否可作用于ES细胞以外的细胞时,发现DIA能够维持DA-1a (小鼠IL-3依赖的白血病细胞系)的持续生长[13]。凑巧的是,美国Genetics Institute公司新近刚克隆出一个能维持DA-1a细胞生长的造血生长因子基因,命名为HILDA(Human Interleukin for DA cells)。更重要的是,序列分析发现,HILDA基因与澳大利亚Donald Metcalf实验室于同一年刚刚克隆出来的人LIF(hLIF)基因[6]序列一致,也就是说HILDA就是LIF[14]。美国Genetics Institute公司的这两个工作连续发表在Nature杂志1988年的同一期中。



鉴于DIA和HILDA/LIF均能够维持DA-1a的生长,Austin Smith就在想,HILDA/LIF是否也能和DIA一样能够抑制mES的分化。结果是令人振奋的!即将HILDA/LIF基因克隆进入非洲绿猴COS肾细胞中进行表达,COS细胞的培养上清可抑制mES细胞的分化。而且,考虑到DIA蛋白与HILDA/LIF蛋白的分子量也相近。因此推测,DIA应该就是LIF[13]。

上面的研究最重要的是发现了LIF可能就是能够抑制mES分化的DIA,也揭示了LIF对不同细胞系具有不同的作用,甚至是截然相反的作用。对小鼠M1白血病细胞,LIF可促进其分化,而对于mES,LIF则抑制其分化。

估计国外科学家之间的沟通是非常多和及时的。同期,发现小鼠和人LIF的澳大利亚Donald Metcalf实验室也敏锐地意识到DIA与LIF的相似性,并证实LIF(无论是人LIF,还是小鼠LIF)能维持mES的未分化状态[15],该研究结果与美国Genetics Institute公司的两个工作发表在1988年Nature杂志的同一期上。也就是说,Nature杂志1988年的同一期连续刊登了3篇关于LIF的文章,且都是讲LIF与mES细胞培养的关系,可见LIF在mES细胞培养中的重要性。

因此在1988年底,也就是人的LIF刚刚被克隆出来的时候,人们就将目光转向了LIF在mES培养中的作用。此后,没人再去验证DIA与LIF是否真为同一种物质,因只要得到了一种能够强力抑制mES分化的因子(即LIF)就足够了。


培养mES,应该用人的LIF,还是小鼠的LIF?

培养mES(小鼠胚胎干细胞)究竟是应该用mLIF(murine LIF, mLIF),还是hLIF(human LIF, hLIF),要从以下三个方面来考量:

第一,性能

hLIF和mLIF的发现者--澳大利亚Donald Metcalf实验室研究证实,hLIF对小鼠M1髓系白血病细胞的诱导分化能力与mLIF相同或更好[6],也就是说hLIF完全可以替代mLIF来培养小鼠细胞。

更重要的是,1988年Donald Metcalf在Nature上馔文专门比较了hLIF和mLIF在维持mES细胞未分化状态的能力,发现两者完全一致,且最适用量均为1000 units/ml[15]。

有趣的是,hLIF可完全替代mLIF作用于小鼠细胞,但反过来,mLIF却对人的细胞无效。这是什么原因呢?

研究表明,hLIF可与小鼠细胞上的mLIF受体(mLIF-R)结合,且亲合力高于mLIF与mLIF受体的结合,这可能是hLIF对小鼠M1髓系白血病细胞的诱导分化能力比mLIF更好的原因。而mLIF不能与人细胞上的hLIF受体(hLIF-R)结合。 所以mLIF不能用于培养人的细胞[16]。

综上所述,hLIF和mLIF在培养mES上的性能完全相同,可以相互替代,也就是说,完全可用hLIF来培养mES。

第二,价格

hLIF和mLIF的价格相差很大,主要原因是mLIF属于专利产品,为一家公司独有,其价格要高出hLIF 2-3倍之多。

Donald Metcalf等发现mLIF和hLIF,以及后期有关LIF的研究工作都是在澳大利亚AMRAD公司的资助下进行的,因此在后来申请专利时,发明者(Inventors)是Donald Metcalf实验室的人员,但受让人(Assignee,即专利的持有者)是澳大利亚AMRAD公司。后来,AMRAD公司自己在研制LIF药物,而将mLIF的专利权授权给另外一家公司仅用于科学研究。

从表1中可以看出,hLIF比mLIF便宜很多,且有大包装以及无动物成分(Animal Free)的hLIF可供选择,因此从性价比考虑,培养mES最好用hLIF。

表1:人LIF和小鼠LIF的比较



第三,与其它动物的交叉反应

我们知道,目前商品化的LIF以人和小鼠为主,其它种属的LIF很难买到。因此,如果您除了研究小鼠的ES(胚胎干细胞)或iPS(诱导多能干细胞),同时还研究其它动物,如牛、猪、犬、羊的ES或iPS,则不得不选用hLIF或者mLIF。

究竟是应该用hLIF,还是mLIF呢?国际上的标准是根据hLIF和mLIF与其它种属动物LIF的同源性高低来确定。表2显示,hLIF与牛、猪、犬、羊的LIF的氨基酸序列一致性均明显高于mLIF,因此国际上通常用hLIF来培养这些动物的ES或iPS[17-20]。

表2:人LIF和小鼠与其它种属LIF的氨基酸序列一致性


总而言之,从性价比以及与其它种属的交叉反应来考虑,用hLIF是明智的选择。


奇怪的现象:hLIF对mES有效,而对hES的培养无效?

hES(human ES,即人ES)细胞的获得比mES晚了整整17年。 1998年,美国威斯康星大学麦迪逊分校的James Thomson和约翰·霍普金斯大学医学院的Shamblott等首先分别从人ICM(Inner Cell Mass,内细胞团) 和PGCs (Primordial germ cells,原始生殖细胞)成功地建立了hES 细胞系[21, 22],从而开启了对hES的科研和临床研究。

依培养mES的经验,在最初hES细胞的培养体系中也加入了hLIF以抑制hES的分化。但结果与预期的相悖,即hLIF无法维持hES细胞的未分化状态。原因何在?

最初,人们推测hLIF不能抑制hES分化的原因是hES细胞表面缺乏hLIF的受体[23]。但美国加州大学圣地亚哥分校(UCSD)的Rohan Humphrey于2004年证实hES细胞上存在hLIF的受体,且hLIF与hES上的受体结合后可以激活JAK/STAT信号传导途径[24]。理论上如果JAK/STAT3信号传导途径被激活了,应该与hLIF或mLIF作用于mES相似,hES也应该保持未分化状态。但结果确是,hES仍然会分化。所以该文作者认为,hES细胞的分化状态与hLIF是否激活hES细胞的JAK/STAT3信号传导途径无关。



其实,不单是hES,LIF对猴(rhesus monkey)和兔(Rabbit)的ES也无效[25, 26]。 问题是,什么因子可抑制这些种属ES(包括人、猴和兔的ES)的分化呢?答案是FGF-basic,即碱性成纤维细胞生长因子,又称FGF-2。文献[26-29]对FGF-basic在维持这些ES细胞未分化状态中的作用进行了详述。


附录

1. mES(小鼠胚胎干细胞)的维持培养液 (有饲养层培养)

以配制500ml mES培养液为例。按下表配制,配制后,4oC可储存2周。




2. hES(人胚胎干细胞)的维持培养液 (有饲养层培养)

以配制500ml hES培养液为例。按下表配制,配制后,4oC可储存2周。




3. hES(人胚胎干细胞)的维持培养液 (无饲养层培养)

为保证培养的最佳效果,最好使用商品化的hES无饲养层培养液,其优点为:

第一,含高品质的重组生长因子(FGF-basic和TGF-β1等)。

第二,极具竞争力的价格。

第三,细胞铺板率高。

4. hLIF培养mES细胞的主要文献

下面精选了一些用hLIF培养mES细胞的文献,望对您有所帮助。

Chung S, Moon JI, et al.
ES cell-derived renewable and functional midbrain dopaminergic progenitors. 108(23):9703-8.

Stavridis MP, Lunn JS , et al.
A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. 134(16):2889-94.

Billon N, Jolicoeur C, et al.
Normal timing of oligodendrocyte development from genetically engineered, lineage-selectable mouse ES cells. 115(Pt 18):3657-65.

Galvin KE, Travis ED, et al.
Nodal Signaling Regulates the Bone Morphogenic Protein Pluripotency Pathway in Mouse Embryonic Stem Cells. 285(26):19747-56.

Saito K, Abe H, et al.
Cloning of Complementary DNAs Encoding Structurally Related Homeoproteins from Preimplantation Mouse Embryos: Their Involvement in the Differentiation of Embryonic Stem Cells. 82(4):687-97.

Tong M, Hernandez JL, et al.
The intrinsic electrophysiological properties of neurons derived from mouse embryonic stem cells overexpressing neurogenin-1. 299(6):C1335-44.

Iha M, Watanabe M, et al.
Effect of ectopic expression of homeoprotein EGAM1C on the cell morphology, growth, and differentiation in a mouse embryonic stem cell line, MG1.19 cells. 143(4):477-89.

Wada H, Kojo S, et al.
Successful differentiation to T cells, but unsuccessful B-cell generation, from B-cell-derived induced pluripotent stem cells. 23(1):65-74.


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