Nature子刊:双功能CRISPR-Cas9可同步实现基因编辑和调控

日期: 2015年09月10日


    

哈佛医学院著名遗传学家George Church教授是基因编辑技术的鼻祖之一:2年前张锋使用CRISPR技术完成了多重基因组编辑,Church则使用CRISPR技术完成了RNA介导的人类基因组编辑。


自此之后,CRISPR/Cas9技术持续火爆,方便快捷的方式迅速风靡科研界,不论是医学研究,农学研究,微生物研究,都对其投入巨大精力。迄今为止,从PubMed数据库中查询,关于Cas9的文章共有951篇,其中最新的一篇是9月7日的Nature子刊——Nature Methods报道了哈佛大学和麻省理工的研究团队开发了双重功能的CRISPR-Cas9系统,能够同时实现基因组编辑和基因调控。


过去:基因编辑和基因调控需要用到不同的Cas9蛋白

众所周知,Cas9是蛋白RNA复合物,其中的小型引导RNA识别特定DNA序列的能力。不论是基因编辑还是基因调控,CRISPR-Cas9的第一步是相同的:引导RNA通过序列互补原则将Cas9带到基因组特定位点,使其与目的基因结合。不过到目前为止,基因编辑和基因调控需要用到不同的Cas9蛋白。基因编辑依赖Cas9的DNA剪切活性;而基因调控需要抑制其剪切活性,只保留Cas9结合靶标基因的能力。在过去,基因调控所用的Cas9变体通常与调控基因表达的蛋白融合在一起。


双重功能的CRISPR-Cas9系统,可同步实现基因编辑和调控

哈佛大学的George Church教授和麻省理工的Ron Weiss教授共同领衔的研究团队开发了一个新策略,成功用一种Cas9同时完成基因编辑和基因调控两项任务。gRNA又称引导RNA,真核生物中参与RNA编辑的具有与mRNA互补序列的RNA。引导RNA为模板的插入编辑,即RNA编辑所需要的信息或者来自向导RNA,或者来自被编辑的RNA自身。


引导RNA的编辑过程


CRISPR/Cas9的成功与否的关键问题在于gRNA的设计,gRNA和非目标区域过多的非特异性结果,脱靶效率较高,特别是靠近PAM的8-10bp不能和非目的区有高同源性。目前为了提供基因组操作的准确性,对Cas9核酸酶进行了突变,突变后的Cas9n 只能切割DNA双链中的一条链,通过两个gRNA引导Cas9对DNA切割:gRNA-I首先以其5’端与前体RNA互补配对,从3’向5’方向插入UMP;gRNA-II继续完成编辑的全过程。该方法可以显著提高基因组编辑的特异性,降低脱靶效率。


选择适合的引导RNA的长度是关键


文章的第一作者之一Alejandro Chavez博士表示:在决定Cas9结合DNA之后是否进行切割过程中,引导RNA的长度起到了关键性作用;过度截短引导RNA使Cas9不能切割其基因组靶点;不过截短引导RNA并不影响Cas9与靶基因的结合。人们可以在此基础上,用Cas9把基因调控蛋白送到特定的基因上,即在此基础上改造的引导RNA和化脓性链球菌的Cas9蛋白,在切割特定基因的同时也可调控其他基因的表达。


双功能CRISPR-Cas9发现的实际应用意义


Church教授表示,以后人类可以根据引导RNA的最适合长度原则,用一种蛋白获得对基因序列和基因表达的直接控制,使得几乎所有DNA都能转变为调控序列,从而进一步操纵细胞。其实际应用意义有2方面:一是揭示重要过程背后的复杂互作(比如癌症耐药性和干细胞分化);二是设计更高级的人工基因回路。


文章的一位共同作者Marcelle Tuttle博士则表示,双功能CRISPR-Cas9可以提升破解致病基因之间的复杂关系的能力;还可以用于工业领域,促进基因工程菌株(E. coli等)大规模生产化合物和燃料,同时保护这些菌株不被其他病原体感染。


Wyss研究所的Donald Ingber博士说认为,此项研究显著提高了CRISPR-Cas9的控制水平,进一步拓展了这一系统的应用范围。


注:文章转自生物探索,如有侵权请联系删除。

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