2016年9-10月CRISPR基因编辑系统重大进展梳理

日期: 2016年11月02日


    

基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一,受到人们的高度重视。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称,Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的,是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。

 

接下来,小编列举最近一段时间CRISPR基因编辑系统取得的重大进展,详情如下所示。

 

1.Cell Rep:利用CRISPR有助HIV治愈方法开发

Cell Reports, doi:10.1016/j.celrep.2016.09.080

 

CRISPR/Cas9的基因编辑系统

 

在一项新的研究中,来自美国加州大学旧金山分校等机构的研究人员利用一种新开发的基因编辑系统发现让人免疫细胞抵抗HIV感染的基因突变。他们基于这种被称作CRISPR/Cas9的基因编辑系统的改进版构建出高通量细胞编辑平台,从而允许他们测试许多种不同的让免疫细胞抵抗HIV的基因变化。

 

在这项新的研究中,Schumann和Hultquist对这种CRISPR技术加以改进:设计一种自动化系统对T细胞进行高通量地和平行地基因编辑。这种新方法允许研究人员让来自健康志愿者体内的上万个T细胞中的不同候选基因发生突变,接着让这些发生突变的细胞接触HIV病毒,随后利用这些细胞进行筛选以便发现哪些突变能够阻断HIV感染。

 

研究人员利用这种新技术让基因CXCR4和CCR5发生突变,其中这两个基因编码不同的HIV病毒毒株用来潜入和感染免疫细胞的受体分子,也是之前的细胞疗法临床试验中的靶标。让其中的任何一个基因失活会成功地阻断相关的HIV毒株对人T细胞的感染。

 

进一步的实验表明同时地阻断HIV病毒侵入T细胞所需的一个基因和这种病毒在这种T细胞中存活和繁殖所需的另一个基因为T细胞构建一种双层安全系统是可行的。

 

为了证实这种新的高通量技术的效率和力量,研究人员也开发出146种不同的基于CRISPR的基因编辑,其中每种基因编辑旨在让45个与HIV整合到宿主细胞中的能力相关联的基因中的一个基因失活。他们鉴定出几个基因的缺失会导致HIV抵抗性,其中的一些基因被之前的研究所预测,而其他的基因之前从没有直接与HIV感染相关联。

 

2. Cell子刊:利用CRISPR/Cas9技术鉴定出AML白血病细胞的弱点

Cell Reports, doi:10.1016/j.celrep.2016.09.079

 

在一项新的研究中,来自英国剑桥大学韦尔科姆基金会桑格研究所的研究人员和他们的合作者对一种CRISPR基因编辑技术进行改进,并利用它发现急性髓性白血病(AML)的新的治疗靶标。他们鉴定出大量基因可能作为抗AML疗法的潜在靶标,并且描述了抑制这些基因中的一种,即KAT2A,如何破坏AML细胞,同时不会伤害非白血病血细胞。

 

为了鉴定出治疗AML的新方法,研究人员利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对AML细胞进行筛选以便寻找它们的弱点。这种技术能够被用来破坏和摧毁细胞基因组中的靶基因。为了实现这一目标,他们对CRISPR-Cas9技术进行优化,以便高效地逐个地破坏AML细胞基因组中的所有基因。这允许他们鉴定出那些遭受破坏后对AML细胞的生长和存活是有害的基因。

 

人类基因组大约有2万个基因。通过对CRISPR-Cas9技术进行改进,并利用它对AML细胞基因组进行筛选,研究人员发现大约500个基因是AML细胞存活所必需的,包括200多个可能被用于药物设计的基因。尽管在这些基因中,有一小部分基因,包括DOT1L、BCL2和MEN1已被确定为治疗靶标,但是它们当中的大多数是新的基因,这就为开发有效地抵抗这种疾病的疗法提供很多可能。

 

研究人员选择KAT2A基因开展进一步研究,同时也是为了验证他们的发现的有效性。通过利用基因技术和基于药物的技术抑制KAT2A,他们证实破坏这个基因会降低AML细胞的生长和存活,但是对正常的血细胞没有影响。

 

研究人员随后破坏转基因小鼠体内的AML细胞中的KAT2A基因,并且观察对这种血癌的影响,从而验证了这一发现。他们发现当KAT2A基因受到破坏时,这些小鼠活得更长。

 

3. “基因魔剪”CRISPR或成镰状细胞贫血症克星

 

当地时间10月12日,一篇关于利用CRISPR-Cas9技术治疗镰状细胞贫血症的论文,在美国学术期刊《科学·转化医学》上发表。由美国加州大学伯克利分校与旧金山分校以及犹他大学组成的研究团队,利用CRISPR-Cas9技术在体外成功修复干细胞中的致病突变基因,给镰状细胞贫血症患提供了潜在的治疗方法。

 

近日发表的该研究正是运用了CRISPR-Cas9,思路很直接,即重写骨髓的造血干细胞中发生突变的基因序列,将致病突变基因修复掉。干细胞具有自我复制能力,这样一来,从理论上讲,镰状细胞贫血症患者可以摆脱该疾病的困扰。

 

在论文中,研究人员介绍,将使用CRISPR-Cas9“改造”过的干细胞移植到小鼠体内后,研究组发现,这些干细胞可以存活至少16个星期,同时没有产生副作用的迹象。在小鼠体内的试验释放了令人欣喜的信号,意味着这一治疗方法或许能在人体上适用。

 

被研究者认为需要在投入临床试验前解决的问题之一是效率。目前,该研究的效率仍待提高。当研究人员从患者身上提取造血干细胞,改造后在体外进行实验时,有缺陷的基因的修复效率是25%。但当研究人员将同样改造过的细胞移植到小鼠体内时,只有5%修复好的细胞能产生完好的血红蛋白。

 

据外媒报道,未来五年内,Mark Walters将和Jacob Corn继续合作,一起启动早期的人体临床试验,检验这种新的治疗方法。

 

4. Nature:CRISPR工具箱被特殊RNA切割蛋白扩充

Nature, doi:10.1038/nature19802

 

日前,一项刊登于国际杂志Nature上的研究报告中,来自加州大学伯克利分校(UC Berkeley)的研究人员通过研究扩大了新发现的CRISPR蛋白C2c2的作用,蛋白C2c2能够靶向作用RNA而不是DNA。

 

研究者指出,C2c2能够作为一种RNA引导的RNA切割酶,然而当前科学家们并不清楚该蛋白如何对RNA实施切割作用,在这项标题为“Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection”的研究报告中,研究者们就通过研究发现,C2c2并不像我们之前认为的仅有一种RNA切割活性,实际上C2c2有两种不同的RNA切割活性,这两种活性能够互相协作来进行强大的RNA检测和降解功能。

 

研究者Doudna教授说道,这项研究扩大了我们对C2c2引导RNA过程的理解,同时也为我们提供了一种新型的RNase应用,C2c2就像一个全副武装的哨兵一样,其能够根据所检测的靶点来攻击所有的RNAs,而这种活性就能够被调节,作为一种自动的放大检测器来用于低廉的诊断检测中。

 

C2c2所具有的两种不同的RNA切割活性中每一种都有其自己的功能,第一种就是产生导向RNAs来促进C2c2寻找特殊的靶向RNA分子,第二种就是会激活一种互补的RNA靶点,从而作为一种常规的RNA切割器来破坏所有存在的RNAs。

 

5. Nature:利用CRISPR/Cas9鉴定出线粒体疾病背后的遗传秘密

Nature, doi:10.1038/nature19754

 

利用CRISPR/Cas9鉴定

 

在一项新的研究中,来自澳大利亚莫纳什大学莫纳什生物医学发现研究所等机构的研究人员鉴定出两个新的基因与线粒体疾病的一种主要病因相关联。他们的研究为更好地对线粒体疾病进行遗传诊断铺平道路,而且也可能有助于鉴定出用于治疗的潜在治疗靶标。论文通信作者为来自莫纳什生物医学发现研究所的David Stroud博士和Mike Ryan教授。

 

Ryan教授说,他们不仅鉴定出两个新的基因ATP5SL和DMAC1与线粒体疾病的一种主要病因相关联,而且也发现30种蛋白组分在驱动线粒体运转的呼吸链酶复合体I 中发挥着重要作用。

 

为了揭示线粒体疾病的一种主要病因背后的遗传秘密,研究人员研究了呼吸链酶复合体I,即协助驱动线粒体的引擎之一。Ryan教授说,相比于细菌呼吸链酶复合体I,人呼吸链酶复合体I是由30多种蛋白组分组成的。

 

利用一种前沿的被称作CRISPR/Cas9的基因编辑技术,研究人员对一系列细胞进行修饰而让它们具有一种不同的遗传组分---每个细胞类型缺乏一个独特的与仅在人类中发现的呼吸链酶复合体I蛋白相关联的基因。他们开发的这种方法可能能够在全世界的实验室中被用来研究更多的导致线粒体疾病的基因。

 

研究人员发现的这两个新的基因参与组装呼吸链酶复合体I。Stroud博士说,他们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术证实让他们鉴定出的这两个新的基因中的任何一个发生突变都会破坏呼吸链酶复合体I和线粒体功能。

 

6. MIT:CRISPR技术再升级,走入精准控制时代

 

如果说到近几年来生物学领域取得的重大突破,或许很多人都会提到CRISPR。作为一项极具潜力的基因编辑技术,CRISPR不但在新药研发的高通量筛选过程中扮演了越来越重要的角色,更有直接应用于临床的能力——今年6月,美国NIH下属的重组DNA咨询委员会投票一致通过CRISPR可用于人体基因编辑。而在7月,四川大学华西医院的科学家也宣布将把CRISPR技术应用于人体,以期治疗非小细胞肺癌。不难想象,未来我们将看到更多CRISPR的应用诞生。

 

作为一款基因编辑工具,在临床应用时,科学家们往往希望CRISPR能够在他们想要的时候,精准地作用于他们感兴趣的细胞,而不希望简单粗放地对所有细胞“一刀切”。这也是目前诸多研究人员努力的方向。而最近MIT的科学家们开发的创新技术,则让CRISPR有望走入精准时代。

 

这项技术的主要研究者Piyush Jain博士是一名操纵RNA的高手。他在加入MIT前,曾有效地利用紫外光,控制了RNA干扰的进程。与RNA干扰类似,CRISPR的基因编辑机理中也离不开RNA分子,这就让Jain博士诞生了用紫外光控制CRISPR的想法。

 

具体来说,Jain博士设计了一类全新的DNA分子,它有两个特性:第一,它能够与向导RNA的序列完美结合,让向导RNA失去了吸引Cas9蛋白的能力;第二,它的结构不稳定。在波长为365纳米的紫外光下,这类DNA会发生断裂,“解放”向导RNA。这些RNA也就能顺利地与基因组上的特异部位结合,引来Cas9蛋白进行剪切。

这项技术的最大意义,在于能够在人为选定的时间,对选定的细胞基因组进行编辑。因此,它也有极为广泛的应用前景。举例来说,有些基因只在癌症发生的某个特定阶段才起作用,而精准的剪切能帮助研究人员更好地了解这些基因在癌症发生过程中的作用,从而提供潜在的新靶点。其次,它也能用更精确的方法关闭肿瘤细胞中的基因,而不影响到周围的正常细胞。

 

7. 首次种植、收获和烹饪利用CRISPR-Cas9进行基因编辑过的蔬菜

 

可能是有史以来首次,利用“基因剪刀”CRISPR-Cas9进行基因修饰过的植物被种植、收集和烹饪。瑞典于默奥大学植物细胞与分子生物学教授Stefan Jansson利用CRISPR-Cas9进行基因修饰过的蔬菜炒意大利面食,然后给一名电台记者吃。尽管这顿膳食仅够两个人吃,但是它仍然是科学能够给全世界的农民和消费者提供健康的、漂亮的和耐寒的植物所迈出的第一步。

 

今年夏天是第一次利用CRISPR-Cas9进行基因编辑过的植物---以一种不被分类为转基因生物的方式---被允许在实验室外进行种植。这确定是欧洲的第一次,而且即便之前在世界其他地方种植过,那也是秘密进行的。这次,这种植物是卷心菜,而且瑞典广播电台园艺电视节目“Odla med P1”参与这种卷心菜收集。这些收集的卷心菜经烹饪后,产生很可能是有史以来第一次利用CRISPR-Cas9进行过基因组编辑的植物烹饪出的膳食。这首次被享用的CRISPR膳食是“CRISPR蔬菜炒意大利干面条”。

 

Stefan Jansson说,“正在讨论中的这些CRISPR植物种植在位于瑞典北部的于默奥大学外面的一座花园的一个平板架(pallet collar)中,而且它们并不与众不同,而且看起来也并不更好看。”但是,它们代表着农业的一个新阶段:科学进步将应用于新的植物物种中,而且在一个较小的或很大的程度上将让全世界的农民获得。

 

8. JCB:CRISPR-Cas9系统在活细胞中的工作机制取得重大突破

Journal of Cell Biology, doi:10.1083/jcb.201604115

 

在一项新的研究中,来自美国马萨诸塞大学医学院的研究人员揭示出CRISPR-Cas9系统在活细胞中的内部工作机制的重要新细节。这一发现可能对人们利用这种强大的基因编辑工具开发治疗方法产生影响。

 

鉴于CRISPR-Cas9系统在活细胞内的工作机制的内在动力学性质并未得到很好地理解,一些运送系统和技术相比而言更容易取得成功。为了观察CRISPR-Cas9系统在活细胞中的作用机制,Pederson博士和同事们开发出一种利用不同的荧光分子对gRNA和Cas9进行标记的技术,因此能够同时追踪它们。

 

研究人员发现当未结合到Cas9上时,gRNA是非常短命的。当Cas9与gRNA组装在一起时,这种复合物更加稳定:大约一半的复合物在细胞核中的寿命大约为15分钟,而剩下的复合物具有更高的稳定性。

 

研究人员还观察到Cas9-gRNA复合物在靶位点上的停留时间决定着DNA是否将被切割。当gRNA序列与靶DNA序列完美匹配时,Cas9-gRNA复合物在离开之前,结合到这种靶DNA序列上长达两个小时,在这期间,靶DNA序列切割也完成了。当gRNA序列与靶DNA序列存在错配时,Cas9-gRNA复合物在靶DNA序列上的停留时间仅仅为几分钟的时间,因而这种切割被破坏了。

 

Ma说,了解到这一点后,科学家们能够潜在地在数学上基于CRISPR-Cas9复合物在基因组位点上的停留时间长短,预测脱靶切割可能在何处发生。

 

9. Cell:首次利用CRISPR/Cas9系统鉴定出寄生虫必需基因

Cell, doi:10.1016/j.cell.2016.08.019

 

CRISPR/Cas9系统鉴定寄生虫基因组

 

在一项新的研究中,来自美国怀特海德研究所的研究人员在顶复门(Apicomplexa)---导致疟疾、巴贝西虫病、隐孢子虫病和弓形虫病的单细胞寄生虫门---中进行首次全基因组筛选。这一筛选有助认识大量的未被研究过的寄生虫基因组,并且揭示为所有顶复门寄生虫所共有的一种蛋白。

 

利用CRISPR/Cas9基因编辑系统改变刚地弓形虫的基因组因Cas9酶的毒性而受到限制。为了克服这个障碍,Lourido团队构建出“诱饵”单向导RNA(gRNA)从而有效地降低Cas9在基因组上的过强活性。利用这种“削弱的”CRISPR/Cas9系统,他们能够破坏刚地弓形虫的8158个基因,并研究它们每个的功能。这种方法鉴定出大约200个基因存在于所有的顶复门寄生虫中,并且这些基因在这些寄生虫感染人类细胞期间促进它们保持适应性中起着重要的作用。

 

在这些基因中,有一个基因编码一种被称作紧密连接蛋白样顶复门微线蛋白(claudin-like apicomplexan microneme protein, CLAMP)的蛋白,它在这种寄生虫侵入宿主细胞中发挥强大的影响。为了进一步分析这种蛋白的作用,和证实它是另一种顶复门寄生虫所必需的,Lourido团队与来自美国麻省理工学院的Jacquin Niles团队合作在恶性疟原虫对这种蛋白的表达进行抑制。在没有功能性CLAMP的存在下,这些疟疾寄生虫不能够在红细胞中生长。

 

尽管这种全基因组CRISPR/Cas9系统在刚地弓形虫中很好地工作,但是一种等价的策略仍然在恶性疟原虫是不存在的。

 

论文共同第一作者、Lourido实验室博士后研究员Diego Huet说,“疟原虫真地很难以相同的方式进行操纵。这是因为它的基因组富含A和T,所以很难在你想要的地方进行切割。疟原虫也缺乏DNA修复的非同源末端连接途径,因而当利用CRISPR/Cas9进行切割时,需要一种修复模板。这些问题代表着在这种寄生虫中开展类似的全基因组测试时所面临的技术障碍,使得弓形虫成为一种疟原虫的一种更加重要的模式生物。我们能够研究的就这么多了。”

 

10. JNCI:重磅!科学家利用CRISPR/Cas9技术使癌症突变失活

Journal of the National Cancer Institute, doi:10.1093/jnci/djw183

 

由于在许多生物医学和生物技术领域均有着广泛的应用,“基因魔剪”CRISPR/Cas9或将完全打开癌症研究领域的大门;日前一项刊登在国际杂志Journal of the National Cancer Institute上的研究报告中,来自德国德累斯顿工业大学 (Dresden University of Technology)等机构的研究人员通过研究发现,扮演癌症驱动子的突变或许能够被靶向作用并且修复,而且这些相关的突变也可以被快速诊断,并被用来改善个体化疗法。

 

作为生物技术研究领域的革命性工具,CRISPR/Cas9在生物医学研究上有着其广泛的用途,其可以实现对细胞基因组中特定位点的DNA进行切割,如今研究人员就发现了一种方法,能够利用该技术诊断并且使得癌症突变失活,从而加速癌症领域的研究。研究者Frank Buchholz说道,通过新一代测序技术我们就能够快速鉴别出癌细胞中的突变,但很多时候我们并不知道到底是哪些突变能够驱动疾病的发生,而且哪些突变是相对良性的。

 

这项研究中,研究者首先对超过50万个报道的癌症突变进行分析,这些突变从理论上来讲能够被靶向作用,并且超过80%的突变都可以被CRISPR/Cas9系统进行切割修饰;随后研究者人员发现CRISPR/Cas9可以在不明显靶向作用健康野生型等位基因的同时,对一系列常见的癌症突变进行特异性靶向作用;此外,携带癌症特异性引导RNAs的Cas9酶类的表达还能够揭开引发癌细胞生长和变异的突变。

 

最后研究者Buchholz指出,这是一项重要的研究突破,因为如今我们可以从普通“乘客”突变中分裂出驱动癌症的突变,而这往往是癌症领域研究的薄弱环节,由于每一种癌症都会表现出特殊的突变组合,因此未来我们或许有可能开发出新型的手段来改善因突变促进癌细胞生长相关的癌症的诊断,当然本文研究仅仅是开始,后期研究人员还需要进行更为深入的研究来继续探索。

 

备注:文章转自生物谷《2016年9、10月CRISPR/Cas重大进展梳理》由赛业生物整理发布

 

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