基因编辑器CRISPR技术的产生与发展

日期: 2016年11月24日


    

最先提出使用工具的人Michael Wiles

 

基因编辑器CRISPR技术的产生与发展/--2013年年初,Michael Wiles同美国缅因州杰克逊实验室的高层管理者坐在一起,并且告诉了他们一种拥有惊人威力的DNA剪切新方法。这家简称为JAX的实验室利用基因工程技术改造以JAXR Mice为注册商标的小鼠,并将其出售给研究人员。它喜欢这样自夸:这“是全世界质量最好和发表次数最多的小鼠模型”。Wiles为该实验室评估和研发新技术。他相信,这个由细菌和古生菌用于保护自身免受病毒侵袭的免疫策略巧妙改编而来的新工具将使JAX改造小鼠的方式发生革命性变化。“在场的十几个人中,有9个人睡着了。”Wiles表示,“当时没人听说过CRISPR。”

 

首个转基因小鼠

Rudolf Jaenisch 在1974 年培育出首个转基因小鼠,并且首次证明了CRISPR 在产生基因敲除小鼠方面的威力

 

如今,绝大多数小鼠培育者都知道CRISPR。长久以来,JAX和其他培育新的小鼠品系的实验室依赖于一个辛苦费力的多步骤过程,其中涉及利用基因工程技术改变小鼠的胚胎干细胞,将其注射进胚胎,并且培育若干代小鼠。即便是JAX最好的团队,也需要用2年时间才能成功改造一只小鼠。CRISPR利用一种可在受精卵上开展针对性基因手术的分子复合物替代了所有这一切。它能在6个月内产生一种被改造的小鼠。

 

通过基因改造使基因被敲除或遗传信息被添加进来的小鼠,成为从癌症、动脉粥样硬化到阿尔茨海默氏症、骨关节炎、肌肉萎缩症和帕金森氏症等一系列人类疾病的关键研究模型。基因敲除和敲入小鼠还为研究特定基因的功能提供了一种强大的工具。

 

“当你在以前培育基因敲除小鼠时,需要具备一些技能。”来自麻省理工学院的Rudolf Jaenisch表示,“现在,你不再需要这些技能。任何傻瓜都能做。”

 

在科学界影响巨大

 

CRISPR代表的是“成簇的、规律间隔的短回文重复序列”。它源自原核生物遗传物质,并且是对后者的一种描述。CRISPR利用向导RNA将生物“剪刀”(通常是和CRISPR相关的蛋白——Cas9)传送到基因组中的某个精确位置。一旦Cas9通过酶解进行了剪切,细胞便会尝试愈合受伤的DNA。一种修复机制会导致基因敲除,而另一种会导致基因敲入。“CRISPR所做的全部事情是剪切DNA。”Wiles介绍说,“其他一些事情都是细胞修复系统完成的。这就是我们能搭便车的地方。”

 

细胞的标准反应是试图将断点处的双链DNA重新拼接起来。这通常需要吞噬掉或添加一些碱基,从而导致基因插入或删除。实际上,这种修复努力会将一些小“排印错误”引入DNA文本,从而使基因丧失功能。

 

双链DNA

 

Jaenisch首次证明了CRISPR在产生基因敲除小鼠方面的威力。在研究人员首次证实CRISPR在哺乳动物细胞中奏效的5个月后,Jaenisch和同事于2013年5月在《细胞》杂志上发表了一篇论文。他们报告称,该技术成功断开了一组小鼠胚胎干细胞中的5个基因,而这在以前是不可能的。更重要的是,他们证实可完全绕过胚胎干细胞,并且同时敲除单细胞小鼠受精卵中的两个基因。研究人员不再需要改造胚胎干细胞并不辞辛苦地培育若干代小鼠,以产生卵子或精子细胞中携带基因突变的小鼠。同时,研究人员若想培育拥有两个突变的小鼠,也不再需要将单突变体杂交并经历一个类似的耗时且烦琐的流程,以获得拥有被改变生殖细胞系的小鼠后代。

 

自此以后,已有500余篇论文详细描述了CRISPR如何敲除以及敲入小鼠基因。“它产生的影响是巨大的。”在1974年培育出首个转基因小鼠的Jaenisch表示。加拿大多伦多大学生物化学家Tak Mak则认为,此项技术真正改变了获得这些被改造动物的时间和效率。据Mak估测,和利用胚胎干细胞相比,利用CRISPR改造小鼠的花费要便宜30%左右,从而使他的平均成本大大降低。

 

革命性意义

 

CRISPR的影响不能仅通过节省成本来衡量。此项技术的便利和速度使得在匆忙之中改造小鼠成为可能,从而解决了来自多伦多病童医院的C. C. Hui最近面临的特定问题:在基因敲除过程中,缺失基因未产生任何可观察到的效应。Hui意识到,被敲除的基因同另一个可能对其作出补偿的基因存在关联。他向在多伦多表型基因组学中心监管小鼠培育的Lauryl Nutter求援。Nutter利用CRISPR使来自初始基因敲除过程的受精卵中的干扰基因发生突变。“我们获得了受精卵,将CRISPR-Cas9注射进去。8周后,Hui便获得了双突变体。”Nutter介绍说,“如果利用胚胎干细胞,可能需要好几年才能完成。”

 

这场革命不只限于培育拥有生殖细胞系突变的小鼠。CRISPR还允许研究人员同时使若干疑似癌症基因在成年小鼠体细胞中发生突变。与此同时,CRISPR敲入可修正成年小鼠体内引发疾病的基因缺陷,比如导致血友病和镰状细胞性贫血的突变。若干研究小组计划将CRISPR注射进正在发育的小鼠体内,目标则是创建可发挥条形码作用的突变并且使科学家得以追踪细胞分化时的细胞谱系。

 

诸如多伦多表型基因组学中心、JAX等小鼠培育公司希望,CRISPR将极大地扩展它们产生的突变范围。“现在,我可以获得拥有3处基因改造的异乎寻常的小鼠,并能再次改造它。”Wiles介绍说,“我们无法利用胚胎干细胞进行连续的基因改造。我们可以将一只拥有两处基因改造的小鼠同另一只拥有两处基因改造的小鼠杂交,但获得全部4处基因改造需要数年时间。”

 

任重而道远

 

不过,从某个方面来说,CRISPR革命步履蹒跚。在Jaenisch实验室首次报告CRISPR的3个月后,他和同事在发表于《细胞》杂志的第二篇论文中提出,CRISPR可轻易实施更加复杂的基因手术,即敲入DNA片段而非简单地令基因丧失功能。作为示范,他们利用CRISPR将荧光标记敲入小鼠受精卵。当特定基因被开启时,荧光标记便会亮起。研究人员还创建了对很多研究来说至关重要的条件突变体。

 

约1/3的小鼠基因对于胚胎发育是必不可少的。如果这些基因从一开始就丧失功能,小鼠便不会诞生。因此,利用胚胎干细胞开展研究的科学家巧妙地设计出一种被称为Cre-Lox 重组的系统。该系统仅在小鼠发育到足以在失去上述基因仍能存活下来后才会将基因敲除。这需要添加额外的DNA:位于靶基因两侧的Lox序列和一个Cre基因。其中,Cre基因可被启动,以产生一种酶,用于修改Lox位点之间的DNA。Jaenisch团队利用CRISPR将同一系统插入受精卵,并且报告称以相对较高的效率培育出条件小鼠——约16%的受精卵产生了拥有正确突变的小鼠幼崽。

 

虽然在英国惠康基金会桑格研究所领导一个团队培育突变小鼠胚胎干细胞的William Skarnes是为Jaenisch的最初报告所折服的众多研究人员之一,但当他试图将该技术带入自己的实验室时却感到了失望。“从他的论文看,这项技术很简单。我非常有信心,它将淘汰掉胚胎干细胞。”Skarnes表示,“但令人失望的是,我们没有人能重现Jaenisch所报告的效率。在JAX实验室,产生拥有正确突变的小鼠幼崽的受精卵仅占1%或2%。同时,很多项目正走向失败。很明显,它并未被证实为一种稳健的方法。”

 

无论目前CRISPR看上去有何种缺点,Wiles强调说,它在改造小鼠方面的潜力不应当被忽视。“CRISPR能做的事情有很多,而我们才刚刚开始入门。”

 

备注:原文转自nature中文摘要 《基因编辑器CRISPR的产生和发展》由"赛业生物(www.cyagen.com)"整理发布

 

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