专家建议:怎样追上CRISPR技术快速发展的步伐?

日期: 2017年03月08日


    

[赛业生物]每个月都有一大波新的CRISPR工具来袭。对于这些热门的技术,我们要不要追?怎么追?对此,《The Scientist》杂志请来一些开发人员,对实验室如何采用这些最新技术提出了一些建议。

 

如何追上CRISPR技术快速发展的脚步?


看点1


Cas9的“死亡开关”


研究人员:加州大学旧金山分校的研究员Joseph Bondy-Denomy


背景:尽管Cas9核酸内切酶颇受欢迎,但由于它们有时在细胞内逗留得太久,而引发脱靶效应,故研究人员正在研究Cas9的“死亡开关”。“人们的目标是有一种方法来关闭它,而不是依赖被动降解,”Bondy-Denomy说。在理想的情况下,Cas9将找到完美的靶点,而之后抑制剂防止它进行其他切割。


方法:Bondy-Denomy的团队找到了四种新的Cas9抑制剂,发现其中两种(AcrIIA2和AcrIIA4)能阻断广泛使用的化脓性链球菌Cas9的作用(Cell, 168:150-58, 2017)。研究人员发现,细菌与入侵的病毒大战时,即使它们有CRISPR-Cas9系统也不一定能取得胜利。这时,抑制剂可能起了作用,于是研究人员着手寻找更多。


如何开始:Bondy-Denomy的团队计划在不久的将来把这四种抑制剂放在Addgene上。AcrIIA2和AcrIIA4在HEK293细胞系中起作用。不过,“任何人都可以用它们来研究他喜欢的Cas9版本,”他说。“1号和3号对我们的研究不起作用,但说不定对别人有用。”


至于何时使用抑制剂,他认为每个实验的时机都是不同的。因此,用户需要自己检查off-target编辑是否减少或消失。当然,也要检查on-target的情况。“我们预计一些on-target活性消失,但我们还不清楚,”他说。


未来:研究小组正利用向导RNA来检验抑制剂。有时,他们希望在特定位点固定一个点突变,这个目标后面需要跟随着一个PAM序列。在编辑之后,PAM序列也需要改变,否则目标位点会被再次切割。这时,抑制剂实现了Cas9的瞬时激活。


看点2


CRISPR + 单细胞测序


研究人员:加州大学旧金山分校的教授Jonathan Weissman以及Broad研究所的核心成员Aviv Regev


背景:与不断扩展的CRISPR-Cas9工具箱一样,单细胞测序技术近年来也发展迅速。研究人员提出了基于液滴的方法,而首批商业化平台也即将上市。


方法:《Cell》杂志上发表的三项研究表明,人们可采用CRISPR-Cas9工具进行基因编辑和基因抑制,然后开展高通量的单细胞RNA-Seq(Cell, 167:1853-66, 2016; Cell, 167:1867-82, 2016; Cell, 167:1883-96, 2016)。


Weissman和Regev的新技术被称为Perturb-seq,此系统的关键在于能够在单细胞的转录组中确定CRISPR带来的扰动。大多数单细胞RNA-Seq方法需要捕获RNA 3’端的poly(A)尾,但向导RNA通常不带有poly(A)尾,因此不能直接捕获。于是,研究人员提出了一种条形码策略来识别向导RNA。另一个关键步骤是开发一种分析管道来解析大量的数据。


如何开始:研究人员使用10X Genomics的平台来进行单细胞RNA-Seq,这对许多人来说还有点陌生(延伸阅读:10X Genomics发布升级版测序平台)。不过,Norman表示,Perturb-seq也可以在96孔板中进行,使用Drop-seq方法。此外,你应当使用你喜欢的Cas9变体。


他们添加条形码和表达向导RNA的载体很快就能通过Addgene获得。利用这种方法,研究人员在理论上能够集中不同实验的细胞,以便降低成本。数据分析可以在标准的计算集群上完成;不过请做好心理准备,挖掘数据可能至少需要几个月的时间。


未来:Weissman的团队计划发布一个更详细的实验方案,他和Regev的团队将发布他们开发的一些计算工具。他们希望这项技术变得触手可及。《Nature Methods》新技术:CRISPR+单细胞测序=?


看点3


归巢向导RNA(hgRNA)


研究人员:加州大学圣地亚哥分校的生物工程系助理教授Prashant Mali和哈佛医学院的遗传学教授George Church


背景:谱系追踪对发育生物学至关重要。在过去的一年中,几个研究小组已采用CRISPR-Cas9方法来追踪细胞命运。他们在细胞发育过程中追踪基因组中的Cas9编辑。


方法:最新突破是归巢向导RNA(homing guide RNA,hgRNA),它指导Cas9到达自己的DNA位点,从而切割自身。这可作为一个多样化的条形码,让Mali和Church的团队追踪培养的细胞群体。这种方法是独特的,因为经过编辑的hgRNA保留了靶向自身的能力,故它们的寿命可能比其他用于谱系追踪的条形码更长。此外,条形码被转录,因此研究人员可以利用RNA检测方法来读取它们,比如Church实验室开发的荧光原位RNA测序(FISSEQ)。Mali在最新的文章中详细介绍了这种条形码(Nature Methods, 14: 195-200, 2017)。


如何开始:Mali认为,这种工具实际上很容易实现。它归结为创造细胞,并融入特定的条形码。检测也不一定是FISSEQ,任何单细胞测序方法也许都有效。与标准的向导RNA一样,归巢向导RNA也需要从实验上检验。在切割时形成的一些自发突变有可能引发大的插入或缺失,并破坏归巢活性。“找到适合你应用的组合将是至关重要的,”Mali说。例如,如果你想要追踪多次细胞分裂,那么你需要一个停留更长时间的向导。“至少在这一刻,我们还没有如何选择最佳hgRNA的确切规则,”他说。


未来:从理论上说,这些条形码可产生足够数量的变体,覆盖整个小鼠大脑中的各种细胞类型。研究小组目前的重点是在体内进行研究。


看点4


对RNA下手


研究人员:Broad研究院的核心成员张锋(Feng Zhang)以及国立卫生研究院的高级研究员Eugene Koonin


背景:常规的CRISPR-Cas9对研究那些转录但不翻译的基因(即非编码基因组)不是太理想。若能直接操控RNA,研究人员将更好地了解RNA,并开发出基于RNA的疗法,如抗病毒药物。


方法:在一项概念验证研究中,张锋与Koonin的团队合作研究了新的CRISPR效应物C2c2,它切割单链RNA中的特定目标(Science, 353:aaf5573, 2016),并降解细菌中的特定mRNA。两个研究小组发现了许多不同“风味”的C2c2。通过与其他人合作,他们正在研究这16个直系同源物,并在不同应用中检验它们。


与抑制基因表达的RNA干扰工具不同,C2c2可定位在细胞内。“你可以把它带到细胞核中,让它在那里发挥作用。它将成为探索非编码基因组的有力工具,”张锋课题组的研究生Omar Abudayyeh说。


如何开始:原始的C2c2质粒可以从Addgene处获得,不过需要注意的是,它并不是针对哺乳动物细胞的使用而优化的。它更有可能在细菌中起作用,或者植物,但他们还没有尝试过,Abudayyeh说。


即使是目前的直系同源物,在尝试靶向某个转录本时,还是存在差异。这不仅是因为序列本身,还在于转录本是否可接近。许多转录本有二级结构,或与蛋白结合而掩盖了序列。为了解决这个问题,他们建议用多个均匀间隔的向导来铺满你的目标。此外,预测RNA结构的计算工具可能有助于你了解特定目标的成功可能。当然,重点是检查蛋白质表达情况,以确定C2c2是否起作用。


未来:除了鉴定C2c2的新同源物,Broad的研究人员正在开发guide-tiling芯片,这有点类似于芯片,不过用寡核苷酸探针作为向导,目的是开发出一组规则,能够帮助人们预测向导的成功可能。[赛业生物科技:www.cyagen.com]

 

备注:原文转自生物通《专家指路:如何追上CRISPR技术快速发展的脚步?》由"赛业"整理发布

 

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