怎样利用CRISPR技术对表观基因组进行修饰?

日期: 2017年03月23日


    

[赛业生物]在表观遗传学中,DNA或组蛋白的共价修饰与基因的表达或沉默有关。为了改变DNA修饰,研究人员过去曾使用组蛋白去乙酰酶等工具,但无法实现靶向的表观遗传修饰。随着基因组改造的浪潮来袭,人们开始使用锌指核酸酶和TALEN来实现表观遗传修饰。如今,新工具CRISPR的出现,让靶向修饰变得更容易。

 

CRISPR技术


激活


P300乙酰转移酶


Charles Gersbach的实验室将催化功能区失活的Cas9(dCas9)与p300乙酰转移酶的催化结构域融合,增加了启动子和增强子区域的H3K27ac组蛋白修饰。如今,他们已构建出pcDNA-dCas9-p300 Core和pcDNA3.3-Nm-dCas9-p300 Core表达载体。


Tet1脱甲基酶


Ronggui Hu的实验室构建出pdCas9-Tet1-CD,能够对哺乳动物细胞进行靶向胞嘧啶脱甲基化。这个质粒可与pcDNA3.1-MS2-Tet1-CD一起使用,来减少甲基化,并激活转录。Rudolf Jaenisch的实验室则提供这种修饰的慢病毒版本Fuw-dCas9-Tet1CD。


抑制


DNA甲基转移酶3A


Vlatka Zoldoš的实验室构建出pdCas9-DNMT3A-EGFP和pdCas9-DNMT3A-PuroR,可在哺乳动物细胞中实现靶向的胞嘧啶甲基化。共表达的标志物EGFP和PuroR实现了转导细胞的选择和分选。Grant Challen的实验室也构建出组成型(pCMV-dCas9-D3A)和Tet依赖型(TetO-dCas9-D3A)的载体。对于慢病毒表达,Rudolf Jaenisch实验室同样提供Fuw-dCas9-Dnmt3a和Fuw-dCas9-Dnmt3a-P2A-tagBFP。


为什么使用表观遗传修饰?


若希望改变基因表达,表观遗传修饰肯定不是唯一的一种CRISPR技术。将dCas9与转录激活因子VP64融合能激活转录,而dCas9与KRAB融合能抑制转录。这两种方法也招募表观遗传机制,那么,使用直接的表观遗传修饰物有优势吗?


当然,使用什么工具,取决于您想要什么样的结果。如果您想要研究一种特定修饰的效果,那么表观遗传工具将是最好的选择。


此外,CRISPR工具的另一个潜在优势是它们的持久性和遗传性。由靶向修饰所留下的表观遗传标记也许能更频繁地被子细胞遗传。Stolzenburg等人曾比较了ZFN-KRAB 和ZFN-DNMT3A,发现KRAB诱导的沉默是短暂的,可快速逆转。然而,DNMT3A诱导的甲基化却能持续存在100天。


在某些情况下,表观遗传修饰的效果比激活剂/阻遏物效果更好。Hilton等人发现,dCas9-p300的转录激活效果优于dCas9-VP64,特别是在靶定远端的增强子时。这些工具的效果可能依赖于细胞类型和背景,因此在设计实验时尝试多种CRISPR工具,也是不错的想法。[赛业生物:www.cyagen.com]

 

备注:原文转自生物通《如何利用CRISPR对表观基因组进行修饰[创新技巧]》由"赛业"整理发布

 

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