基因编辑技术那么热门,可你都会用吗?

日期: 2017年04月11日


    

[赛业生物]基因编辑是一种遗传工程技术,针对某个序列已知但功能未知的序列,通过改变生物的遗传基因,使其特定的基因功能丧失作用,通过研究对生物体造成的影响,进而推测出该基因的生物学功能。本文为你科普基因编辑三大技术:


基因敲除


进行DNA水平编辑。一般用于构建基因敲除鼠模型。


CRISPR/Cas9:CRISPR/Cas9系统作为细菌和古细菌的获得性免疫系统,通过RNA介导特异性的切割外源遗传物质,用以对抗入侵的病毒和质粒。使用Cas9切口酶和一对sgRNA,两个相近的切口造成DNA双链断裂,诱导细胞发生非同源末端连接修复,造成目的基因的突变。


CRISPR/Cas9技术自问世以来,取代“锌指核酸内切酶(ZFN)”、“类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN),成为科研、医疗等领域的有效工具”.一般通过体外转录得到sgRNA与cas9的mRNA,通过注射到原核期受精卵内,移植到假孕母鼠体内获得基因编辑的小鼠进行基因功能研究。

 

CRISPR/Cas9技术

  

构建方法:


确定待敲除基因的靶位点。


设计识别靶位点的识别的一对sgRNA。


构建可表达sgRNA的Cas9质粒。


体外转录sgRNA 和Cas9 RNA。


将sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵检测sgRNA活性。


将有活性的sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵建立Founder。


将Founder自交得到F1代。


适用范围:


制备敲除鼠,利用敲除鼠进行基因功能的研究;进行细胞水平敲除基因时,可以选择慢病毒载体,构建lenticrispr-v2质粒,通过包装病毒进行细胞水平敲除。


基因敲减


RNA水平,是指通过降解具有同源序列靶基因的mRNA,达到阻止基因表达的作用。一般用于细胞水平敲减基因。


(1)RNA干扰:


是siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物RISC。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上,并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA,该mRNA发生降解而导致基因表达沉默,是一种特异性的转录后基因沉默。


一般合成针对靶基因的siRNA,通过转染的方法使之进入细胞内,使靶基因沉默。这一方法受转染效率的影响较大。目前有不少基因的siRNA已经有商业产品,所以使用时买来就可以了,比较方便。

 

RNA干扰

  

适用范围:


一般通过公司合成后,通过转染细胞进行细胞水平敲减。


(2)shRNA:


“短发夹RNA”,shRNA包括两个短反向重复序列,中间由一茎环(loop)序列分隔的,组成发夹结构,由polⅢ启动子控制。随后再连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。


构建shRNA的病毒表达载体,常用的病毒载体有腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体等,机制与质粒载体相似,利用了病毒感染细胞效率比较高的特点,解决了用质粒载体转染效率低的缺陷。

 

设计RNA

  

构建方法:


shRNA设计:设计RNA干扰序列是RNAi实验的关键。


载体构建:可根据实验需求选择慢病毒、腺病毒载体。


转染细胞:常用的方法包括磷酸钙转染、脂质体转染、电穿孔转染等


观测GFP 荧光和稳定表达细胞系筛选:可用于带有GFP标签的质粒载体。


检测RNA 干扰效率:可以在蛋白水平或mRNA水平检测RNA干扰效率。


适用范围:


一般通过构建慢病毒、腺病毒等进行细胞水平敲减。[赛业生物:www.cyagen.com]


备注:原文转自-解螺旋《基因编辑那么热,可是你都会用了吗?》由【赛业生物】整理发布

 

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