在药物靶标筛选中,CRISPR和RNAi狭路相逢?

日期: 2017年05月04日


    

赛业生物/---最近的一项利用CRISPR开展的研究驳斥了多年来利用RNA干扰(RNA interference, RNAi)针对一种得到很好研究的癌症药物靶标的研究结果[1]。但是对作为一种筛选工具的RNAi而言,这是将它钉在棺材里的最后一颗钉子吗?

 

CRISPR和RNAi

RNA干扰,图片来自Richard Robinson from Wikipedia。


大量的RNAi研究已证实编码一种蛋白激酶的基因MELK对癌细胞是必需的。当美国冷泉港实验室的研究人员着手证实癌细胞对MELK基因的依赖性时,他们并未期待会有什么意料之外的发现。但是,他们随后发现利用基因编辑工具CRISPR-Cas9剔除MELK基因并未对癌细胞产生显著的影响[1]。这就与之前的RNAi研究结果完全相反。


当这项研究上个月发表在eLife期刊上[1]时,美国桑福德-伯纳姆-普利贝斯医学探索研究所癌症研究员Alexey Terskikh(未参与这项研究)告诉《科学家》杂志,“这是一项精心设计的研究。”他补充道,它提供一个例子说明“为何人们应当采用CRISPR作为一种更加严格的方法来解决他们提出的问题。”


这项研究绝对不会是驳斥基于RNAi实验获得的关于必需基因和潜在的药物靶标的发现的第一项研究。相反,它进一步证实了多年来的报道:RNAi技术存在重现性差、具有脱靶效应以及有时会导致完全错误的结果。


在提到发表在eLife期刊上的关于MELK的这篇论文破坏了人们对RNAi技术的信心时,美国斯坦福大学的Michael Bassik说,“恰当地说,RNAi长期以来就存在问题。在某种程度上而言,这项研究确实破坏了人们的信心。当然,如果你阅读了这篇论文,想知道,‘我应当采用RNAi筛选还是CRISPR筛选?’那么答案就是全部采用CRISPR筛选。”


但是它意味着利用RNAi鉴定新的药物靶标之路终结了?不一定。Bassik说,“在发表这类笼统的观点时,你必需非常小心。”他补充道,RNAi盔甲上的这个最新的裂缝“并不意味着RNAi筛选在鉴定药物相互作用时它是无用的。”


坏名声


RNAi技术利用小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)触发具有互补序列的靶mRNA(即信使RNA)降解,因而抑制细胞中的特定基因表达。在2007年左右,这种技术在鉴定药物靶标上非常流行,此后,全基因组RNAi筛选准确找出与对化疗药物敏感性增加相关的基因[2]。


但是RNAi的作用机制是非常不精确的。荷兰癌症研究所的René Bernards(他的实验室使用过CRISPR和RNAi)说,到目前为止,“我认为每个人都应注意RNAi的脱靶效应。它是这种技术的最大缺点。”导入的RNA分子不仅较低特异性地与脱靶转录本序列相互作用[3],而且它们也不可预测地干扰调节基因表达的细胞机制。


Bassik说,“这能够产生非常广泛的影响”,并且补充道,当这些影响具有毒性时,研究人员可能最终对一种基因在细胞中的作用形成错误的看法,“有大量的例子表明制药公司优先利用RNAi实验结果来寻找药物靶标,结果仅发现这些结果是错误的。”


最为声名狼藉的被错误识别的药物靶标之一是蛋白激酶STK33。2009年,研究人员已鉴定出STK33是携带着一种已知的癌基因突变的人癌细胞的活力所必需的。这项原始的研究的结果并不能够在其他的实验室中得到重复,随后经证实,它一点也不是必需的[5],不过在此之前,它作为一种潜在的药物靶标吸引了制药行业的大量关注。


此后,随着CRISPR-Cas9基因编辑技术变得越来越精确,在寻找新的药物靶标时,人们对这种技术替换RNAi的潜力具有也越来越浓的兴趣[5]。多个实验室(包括Bassik团队和Bernards团队)最近利用这两种技术开展的筛选进行面对面的比较。


Bernards说,“当我们采用CRISPR试剂时,脱靶效应明显不那么严重。这种技术具有更好的选择性。”他补充道,根据他的团队对这种方法的可重复性的比较结果,“明显的是,CRISPR筛选具有更少的干扰结果。我认为每个实验室都得出了相同的结论。”


美国哈佛医学院的Tim Mitchison(之前研究过MELK)说,结果就是,一些实验室“真地抛弃了RNAi,而选择了CRISPR。很多人认为CRISPR发挥得更好。”


还不是最终结局


尽管明显对RNAi筛选缺乏信心,很多研究人员迄今为止并不准备在药物靶标鉴别上放弃这种技术。RNAi敲降(RNAi knockdown)和CRISPR敲除的工作机制不同:前者部分抑制基因表达,而后者完全抑制基因表达。当考虑药物开发时,这一区别变得非常重要。


Bernards注意到,“对任何一种药物而言,实现对靶标100%的抑制是非常罕见的。你可以认为如果你需要完全清除所有的靶蛋白来产生一种表型,那么药物产生这种情形的可能性到底有多大?答案很可能是不太可能的。”


他补充道,就目前而言,RNAi可能在这个方面具有优势,不过CRISPR可能很快会赶上,这多亏CRISPR干扰(CRISPR interference, CRISPRi)技术[6]。CRISPRi是一种利用CRISPR的特异性调节转录受到的部分抑制。


一些研究人员认为尽管存在一些挫折,RNAi可能仍然有用的另一种原因在于相比于在应用时有时使用的有缺陷的方法,过去的错误更少地反映在这种技术上。Bernards解释道,在理想情形下,RNAi敲降结果应当会利用研究人员称作为“金标准”的方法加以验证。


他说,“你导入抵抗RNAi的基因版本,比如,靶位点序列发生突变的基因版本,观察这是否会拯救这种表型”,并且补充道,这个过程在很多针对潜在药物靶标的RNAi研究中缺乏了,“如果你不这样做,那么你会给自己带来潜在的麻烦。”(毫无意外的是,2013年, MELK在胶质母细胞瘤细胞中接受拯救治疗[7]。)


当然,CRISPR仍然有它自己的问题。美国斯隆凯特林癌症纪念中心RNAi核心机构主任Ralph Garippa注意到,仅最近将核酸切割酶Cas9引导到基因组中的特定位点上的向导RNA(gRNA)文库进行改进,实现了较少的脱靶效应[8]。与此同时,他强调道,“脱靶效应不是归于零,而不是变得更少”,并且补充道RNAi文库继续得到改善。Garippa告诉《科学家》杂志,“对于任何新出现的技术,你必须想方设法克服它的细微差别和缺点。”


与此同时,一种显而易见的解决靶标鉴定和验证问题的方法是在进行临床研究之前,利用CRISPR和RNAi而不是利用单个方法验证靶标。Bernards说,“我们针对人基因组中的每个基因使用CRISPR和短发夹RNA试剂。因此,当我们利用CRISPR观察到一种表型时,我们利用短发夹RNA进行验证,反之亦然。我认为这将是比较理想的。”(www.cyagen.com《赛业生物》)


相关新闻阅读:


1.CRISPR/Cas9 mutagenesis invalidates a putative cancer dependency targeted in on-going clinical trials


eLife, Published March 24, 2017, doi:10.7554/eLife.24179


2.Synthetic lethal screen identification of chemosensitizer loci in cancer cells


Nature, 12 April 2007, doi:10.1038/nature05697


3.Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi


Nature Biotechnology, doi:10.1038/nbt831


3.Synthetic Lethal Interaction between Oncogenic KRAS Dependency and STK33 Suppression in Human Cancer Cells


Cell, 29 May 2009, doi:10.1016/j.cell.2009.03.017


4.STK33 Kinase Is Not Essential in KRAS-Dependent Cells–Letter


Cancer Research, December 2011, doi:10.1158/0008-5472.CAN-11-2495


5.Screening with CRISPR


6.Dial It Up, Dial It Down


7.Maternal Embryonic Leucine Zipper Kinase (MELK) Reduces Replication Stress in Glioblastoma Cells


The Journal of Biological Chemistry, August 16, 2013, doi:10.1074/jbc.M113.471433


8.Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9


Nature Biotechnology, Published online 18 January 2016, doi:10.1038/nbt.3437


9.RNAi’s Future in Drug-Target Screening


备注:原文转自-生物谷 《在药物靶标筛选中,CRISPR和RNAi谁与争锋?》【赛业生物】整理发布

 

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