基因编辑的“前辈”原来是它们

日期: 2017年07月17日


    

"基因编辑,赛业生物“

图片来自网络

 

(赛业生物/讯)基因编辑对生物医学研究的影响不亚于30年前的PCR。近年来,锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子(TALEN)和规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)已经掀起了一浪又一浪的基因编辑高潮。


从时间上看,ZFN是最早的,接着是TALEN,最后是CRISPR。每一次成功的交替,都伴随着操作更简便、应用更普及。CRISPR的出现,大大简化了基因编辑的操作,因此被研究人员广泛采用。


尽管如此,ZFN和TALEN仍被人们认为在基因治疗中前途光明,因为它们比CRISPR更加精确。Schaefer等人近期在《Nature Methods》上发表文章,通过深度测序揭开CRISPR的脱靶效应。作者指出:“我们发现了大量意想不到的单核苷酸变异,而不是像人们普遍认为的那样,CRISPR主要在与sgRNA同源的区域产生插入缺失。”


“CRISPR的简便让基因组编辑迅速普及,改变了疾病研究的面貌,”MilliporeSigma的基因编辑负责人Martha S. Rook博士谈道。“然而,对于那些需要知识产权专利的关键研究,成熟的基因编辑技术(如ZFN和TALEN)仍然是首选方法。”


重回ZFN?


CRISPR是依赖基因靶向的向导RNA来结合特定的序列,而ZFN则不同,它是由蛋白构成的。这些结构域蛋白经过优化,可提高精确度和特异性,适合临床基因编辑。


据Sangamo的副总裁Michael Holmes博士介绍,ZFN需要的蛋白改造知识比CRISPR要多。“这也就是为什么研究人员在考虑基因编辑时,第一时间想到CRISPR,但对于治疗而言,最简单的也许并不是最好的。”


2015年12月,美国FDA批准了Sangamo的B型血友病治疗方案(SB-FIX)。这种方案是在患者肝脏细胞的白蛋白基因位点中插入治疗基因。“当我们将治疗基因插入这个非常强大的启动子时,我们能够将肝脏作为蛋白生产工厂,这样只需要编辑少量肝细胞就能产生治疗水平的蛋白,”Holmes说。


这种经过优化的ZFN有着出色的特异性,且脱靶修饰的水平低于深度测序的检测极限。“在基因组指定的位点获得80%以上的编辑效率,且脱靶效应低于检测限,这种能力正是治疗性的基因编辑所需要的,”Holmes补充说。


Sangamo的锌指平台对基因组所做的修饰在遗传上是稳定的。试剂的作用是瞬时的,但它们赋予的性状却是永久的。“天然的进化动力当然存在,这会导致细胞在许多代后不分裂,或丢失染色体。不过,它与未经过编辑的基因组相比既没有增加,也没有减少,”Holmes解释说。


Proxy-CRISPR


当然,CRISPR在许多应用上还是具有独特的优势。Rook认为,CRISPR设计简单,让研究人员能轻松获得现成的CRISPR全基因组文库。此外,与ZFN和TALEN相比,它的切割效率提高,也增加了其在全基因组筛选和单个靶点编辑中的应用。


MilliporeSigma最近宣布对CRISPR进行改进,以便让这个工具更加高效、灵活和特异。他们将利用Proxy-CRISPR来接近那些之前无法触及的基因组区域,从而加速药物开发和基因治疗。这种方法最近表达在《Nature Communications》杂志上。


Proxy-CRISPR利用CRISPR的两次结合来实现高效切割。第一次结合是利用缺乏DNA核酸内切酶活性的Cas9;第二次是通过同样无法单独切割人类DNA的CRISPR系统。据Rook介绍,这种策略是模拟天然存在的现象,因为许多不同的CRISPR系统与不同的DNA序列结合。


Proxy-CRISPR允许DNA靶点是多样化的,就好像许多个体的致病位点都有所不同。“为了纠正各种可能的致病突变,这就需要编辑技术能够靶定几乎所有的DNA序列,”Rook谈道。“Proxy-CRISPR方法为使用各种CRISPR变体打开了大门,它们能够揭开基因组差异的意义。”


灵活应用


Poseida Therapeutics也发现,CRISPR技术的改进能够克服脱靶效应。这家公司最近发布了临床前数据,表明它家的高保真基因组编辑系统NextGEN™ CRISPR可以产生“万能供血者”嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)。大家都知道,这是癌症免疫治疗的重要平台。


Poseida目前已经积累了多个基因编辑平台。除了NextGEN CRISPR,Poseida还采用piggyBac™ DNA修饰系统、XTN™ TALEN位点特异核酸酶以及Footprint-Free™基因编辑。


“对于不同类型的细胞而言,没有一种永远无敌的技术,具体要取决于你想做什么,”Poseida的CEO Eric Ostertag说。“CRISPR试剂设计起来更简单、更快速,比TALEN也略为便宜。但是,如果你有TALEN的经验,并且打算上临床,那么成本和设计上的差异几乎可以忽略不计。”


NextGEN CRISPR的优势在于它可以应用在活化和静息的T细胞,这与很多只作用在活化细胞上的技术相比就具有更大的灵活性。Ostertag表示:“干性表型对产品效果和持续时间都是至关重要的,因此我们倾向于改造静息细胞。”NextGEN CRISPR在静息T细胞上效果很好,但TALEN不行。


野生型的CRISPR利用Cas9蛋白和向导RNA来切割DNA。作为天然的核糖核蛋白,它的切割效率很高,但非常马虎,带来一些不想要的脱靶突变。Poseida的NextGEN CRISPR则使用了类似锌指和TALEN的核酸酶,需要两部分同时存在才能切割,从而保证了on-target的特异性。

 

来源:生物通《基因编辑,别忘了还有ZFN和TALEN》赛业生物整理发布

 

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