CRISPR-Cas基因编辑中不可预见的突变

至读者：CRISPR-cas9基因编辑可修复致病性基因突变。例如，在最近的研究中，我们利用CRISPR-cas9技术修复了Pde6b基因的突变，使失明的rd1小鼠的视力得到恢复。但是，由于sgRNA导致的非靶向区域出现二次突变的问题依旧令人担忧。计算机算法可以为一个给定的gRNA生成可能的脱靶位点，但也可能会错过某些突变。全基因组测序（WGS）已经被用来检测小片段插入和删除（插入/缺失突变），但没有被用来检测整个机体中的点突变（SNV）。为了识别出全部的脱靶变异，我们对经CRISPR-cas9编辑的小鼠进行全基因组测序。结果显示，点突变数目远远超过广泛认为的由CRISPR导致的发生在sgRNA同源区域的插入/缺失突变。

我们在细胞中测试了四种sgRNA，然后选择了在活体内具有最高活性的sgRNA作为目标。DNA分离自两只经CRISPR编辑的小鼠（F03和F05）和一只没有编辑过的对照组。对CRISPR-cas9编辑过的小鼠进行平均深度为50x的测序，对照组30x（变体的识别至少需要的测序深度是23x）。用多变体识别软件的测序峰图来识别插入/缺失突变和点突变（图1）。

图1.在经过基因治疗的老鼠模型中，CRISPR基因编辑引入的突变数目高出想象。(a)Venn图显示了全基因组测序数据检测到的点突变。(b)F03、F05小鼠以及它们之间共同的变异类型的统计。

在经CRISPR编辑的小鼠中，目标等位基因被修复。那些只出现在CRISPR编辑的动物而不出现在未被处理过的对照组的变异，则被判定为脱靶效应。测序峰图显示在F03小鼠中有164个插入/缺失突变和1736个点突变（其中有63个插入/缺失突变和885个点突变发生在无关基因上），在F05小鼠中有128个插入/缺失突变和1696个点突变（其中有51个插入/缺失突变和865个点突变发生在无关基因上）。在这两组被处理过的小鼠中检测到117个相同的插入/缺失突变和1397个相同的点突变，这说明CRISPR编辑的靶点不是随机的。检测表明点突变的类型更倾向于碱基的转换而不是颠换。CRISPR编辑过的小鼠检测到的突变率明显高于自然生殖系（每一代从头测序，检测到3-4个插入/缺失突变和90-100个点突变）。

作为参照，每一个变异都与小鼠dbSNP数据库的FVB/NJ基因组做对比，每一个点突变都与小鼠基因组计划（v3）的全部36品系做对比。在这些品系的基因组中，完全找不到CRISPR脱靶产生的变异。这就更加确认了那些全基因组测序所检测出的点突变是由CRISPR-Cas脱靶导致的。

所有的测序峰图分别检测到F03小鼠外显子区域中的6个插入/缺失突变和60个点突变，F05小鼠外显子区域中的3个插入/缺失突变和51个点突变，以及在蛋白质编码序列中导致非同义突变的5个插入/缺失突变和24个点突变。在这之中，5个插入/缺失突变和1个引入了不成熟的终止密码子的点突变被认为是有害的。有一些突变的蛋白质编码基因与人和/或小鼠的表现型密切相关。在29个蛋白质编码序列的变异中，有7个在两只小鼠中都能观察到。其中选择了24个CRISPR相关的变异进行Sanger测序以确认结果（附加图2）。在预测的前50个脱靶序列中，没有任何一个发生了突变。另外，sgRNA和真正脱靶区域（包括编码区和非编码区）附近的序列之间的同源性很低（附加图3），这一结果表明计算机模型不能预测真正的脱靶位点。

总的来说，这些结果表明至少某些sgRNAs在活体里可以靶向与目标基因不相关的位点。这些意外产生的变异需要慎重考虑。这些发生在非编码RNA或其他正常基因区域的许多突变，对一些关键的细胞活动可能会造成有害的影响（附加图4）。即使CRISPR编辑的小鼠没有表现出明显的眼睛外观表型，但也存在随时间变化表型发生改变的可能性，或者繁殖成纯合体后表型发生变化。

目前的研究表明对插入/缺失突变和点突变进行全基因组测序是确定脱靶效应最全面彻底的方法，同时揭露了具有潜在危害性的CRISPR-Cas诱发的突变数目也比之前报道的高出很多。目前尚未清楚是改进sgRNA的设计还是采用高精度的Cas才能降低脱靶突变，又或者是在活体内任何sgRNA都普遍存在脱靶问题。

我们的研究意在提醒研究者肩负的责任，并仔细对他们的采用gRNA和Cas做脱靶突变相关的检测。在CRISPR平台能真正无风险地使用之前，尤其是在临床应用之前，我们可能需要进行更多的研究去增加CRISPR-Cas的精确度，并考虑到它可能产生的脱靶突变。以后涉及到新的CRISPR方法和新试剂的研发应该考虑运用全基因组测序来确定活体中的脱靶突变。

文本附加图：

附加图1：点突变的类型更倾向于碱基的转换而不是颠换

热力图代表着CRISPR编辑的动物点突变的类型和百分比。对于F03和F05小鼠来说，大部分的突变形式是G变为A和C变为T。

附加图2：Sanger测序法检测在全基因组测序中出现的CRISPR引入的突变

a.F03的一个编码区出现杂合子突变，F05跟野生型一致。b.内含子区域的一个点突变存在于F03和F05小鼠中。c.snoRNA中的一个点突变出现在F03和F05小鼠中。

附加图3：先导RNA与脱靶区域的序列比对并没有呈现同源性

a.预测的前10个脱靶区域与gRNA进行比对，这些序列与gRNA有80%-95%同源性；b.选择了编码区中的10个实验检测到的点突变区域的序列与gRNA进行比对，在实验组小鼠中检测以上所有区域，发现这些序列与gRNA有15%-45%的同源性；c.选择了非编码区中的10个实验检测到的点突变区域与gRNA进行比对，在实验组小鼠中检测以上所有区域，发现这些序列与gRNA有5%-65%的同源性；d.选择了编码区与非编码区中的10个实验检测到的插入/缺失突变区域与gRNA进行比对，在实验组小鼠中检测以上所有区域，发现这些序列与gRNA有25%-65%的同源性。

附加图4：CRISPR造成的脱靶突变可能引起预期之外的表现型

饼状图反映了CRISPR编辑的小鼠进行全基因组测序所检测到的点突变和插入/缺失突变，生物型是由SNPEff软件指定的，内含子区域不属于指定范围。

备注：参考原文《Unexpected mutations after CRISPR–Cas editing in vivo》。