杜杰教授团队Circulation发文,揭示心力衰竭的内源保护性转录调控机制

日期: 2017年06月21日


    

    

上个月,首都医科大学的杜杰教授团队在《Circulation》(IF=19.309)发文“Cardiac Fibroblast-Specific Activating Transcription Factor 3 Protects Against Heart Failure by Suppressing MAP2K3-p38 Signaling”。揭示了内源保护性转录因子ATF3抵抗心力衰竭发生的机制,加深了对心力衰竭转录调控网络的认知。


恭贺杜杰教授团队


恭喜赛业生物ATF3转基因小鼠


荣登《Circulation》

心力衰竭是多种心血管疾病的严重和终末阶段,它是指心脏的收缩功能和(或)舒张功能发生障碍,不能将静脉回心血量充分排出心脏,导致静脉系统血液淤积,动脉系统血液灌注不足,从而引起心脏循环障碍症候群。

 

心力衰竭在我国有着较高发病率和患病率,并呈不断增长的趋势。导致心力衰竭的常见原因是心室重塑,然而,调节心室重塑的分子机制仍然知之甚少。心力衰竭(HF)可以被看作是一种抗增生性基因调控障碍,基因表达的特异性调节主要通过转录因子实现,转录因子有希望成为新的治疗靶标。近日,来自首都医科大学的杜杰教授团队在《Circulation》 (IF=19.309)发文“Cardiac Fibroblast-Specific Activating Transcription Factor 3 Protects Against Heart Failure by Suppressing MAP2K3-p38 Signaling”,揭示了内源保护性转录因子ATF3抵抗心力衰竭发生的机制,为研究转录因子在心血管疾病的作用提供思路。

 

该研究以两种高血压性心衰动物模型的心脏转录组数据为基础,并采用双重原位杂交和活细胞分选等技术,发现了调控心肌肥厚和心衰的关键转录因子ATF3,并确定了心脏成纤维细胞是ATF3表达的细胞来源。随后,使用通过原核显微注射方法,注射线性化的pRP.ExBi-EF1A-loxp-stop-loxp-mAtf3质粒,获得条件性Atf3基因过表达的转基因小鼠(过表达的ATF3转基因小鼠由赛业生物科技提供),进一步证实了ATF3可保护心脏免受高血压诱导的心力衰竭,揭示了其保护机制。为验证此发现的临床应用,研究团队利用肥厚性心肌病患者心脏组织证实了此发现,并发现心脏成纤维细胞特异性递送ATF3可有效阻止了心肌肥厚和纤维化发生。

 

该项研究发现了转录因子ATF3的活化是内源防止心力衰竭发展的关键事件,为心力衰竭提供了新的治疗思路。

1、ATF3在高血压动物和心力衰竭患者的心脏组织中是如何持续高表达的?

为了识别调节高血压心脏重塑的转录因子TF,对来自两种不同的高血压心脏样本进行转录组表达检测。重塑模型:Ang II输注(7或28天,心室重塑显著和不显著的两个代表性时间点, RNA-seq,三分组,每组2个生物学重复)和TAC处理(28天,AffymetrixClariom D array,两分组,每组2-3个生物学重复)。结果发现:与对照相比,在Ang II输注后7或28天分别有1019和647个差异表达基因(筛选标准: p <0.05,FC> 2)。与相对对照相比,AngⅡ输注28天后和TAC共有537个差异基因(筛选标准:p <0.05;倍数变化> 1.5)。

为了识别编码TF的DEGs,从TRANSFAC数据库确定的1100个候选TF(TF转录因子生物信息学预测)和以上两组差异基因进行比较,分别筛选出41个TF(Ang-II输注组后7天); 29个TF(Ang-II输注组后28天)和42个TF(TAC组后28天)DEGs是TF编码基因。进一步分析发现,Ang II输注后7或28天两个时间点共有22个差异表达的TF基因,在Ang II输注组和TAC组之间共有7个差异表达的TF基因。在这7个TF中,ATF3基因持续显著上调。测序和芯片数据结果一致,在Ang II输注和压力心脏中ATF3mRNA和蛋白水平显著上调。接下来,构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI相互网络),预测出ATF3与48种重要蛋白质相互作用,包括参与免疫应答的复合物(Rela,Jun,Junb,Jund,Fos),纤维化(smad2 / 3)和凋亡(p53,ATF4,ATF2)。

同时在临床肥厚性心肌病(HCM)患者上进一步验证,发现ATF3在人心脏组织中的转录水平和蛋白水平显著上调。总而言之,这些结果强烈表明ATF3可能发挥监管作用高血压心室重塑。

 

2、如何确认心脏成纤维细胞是刺激表达ATF3的主要细胞类型?

不同心脏细胞类型以不同的分子机制来调控整体心脏功能。研究进一步确定了ATF3在高血压心脏表达中的细胞性来源。原位杂交(ISH)显示:在盐水处理的动物中ATF3染色非常弱,而Ang II输注后增强。重要的是,ATF3染色富集在心脏间质,不在心肌细胞或血管细胞内。双重组织切片染色结果显示ATF3信号主要在成纤维细胞(DDR2 +,Col1a1 +)中富集强,在巨噬细胞(CD68 +)中富集较少。同时,通过荧光激活细胞分选计数将CD45-PDGFR-Į-CD31-心肌细胞,CD45-PDGFR-Į+心脏成纤维细胞,CD45-CD31 +内皮细胞和CD45 + F4 / 80 +巨噬细胞分选出来,并用qRT-PCR检测ATF3在不同心脏细胞中表达水平。

 

3、心脏成纤维细胞中ATF3上调是高血压心室重塑和心力衰竭过程中自我保护的代偿性机制吗?

前期结果已经证明ATF3在心衰心脏的成纤维细胞中显着上调,接下来需要进一步确定ATF3上调是否有助于保护机体免受心室重塑。本研究采用了四种独立的方法来证明。

第一种——基因敲除方法。ATF3敲除(ATF3KO)小鼠和野生型(WT)小鼠进行Ang II输注。Ang II输注后WT和ATF3KO小鼠血压都有升高,差异不大,而在胶原沉积上ATF3KO小鼠中明显高于WT小鼠。且a-SMA蛋白、胶原I和TGF-β的转录水平显著上调。Ang II输注后,与WT相比,ATF3KO小鼠体重增加更显著,心肌细胞肥大更严重, Myh7和ANP(肥大相关基因)的mRNA水平也显著升高。这些数据表明ATF3上调是心衰过程中的一种自我保护机制。

第二种——病毒介导的拯救方法。为避免心肌细胞中ATF3过表达,建立了一种miRNA辅助/慢病毒(LV)介导的系统。mir-1a和mir-133a是心肌细胞中最丰富的miRNA,研究者设计了携带有Ubi启动子驱动的ATF3表达盒的载体盒,该启动子包含2个串联拷贝的在3'末端的mir-1a-3p和mir-133a-3p链的22-bp互补靶序列(LV-ATF3-mir1/133TS)。LV-control-mir1/133TS作为载体对照。我们首先将LV-ATF3-mir1/133TS和LV-control-mir1/133TS(50PFU /细胞)载体转染原代心肌细胞和成纤维细胞(分离自ATF3KO小鼠)。在LV-ATF3-mir1/133TS转染的心脏成纤维细胞中ATF3的表达明显上调,而在心肌细胞中仅略有上调。LV载体通过尾静脉注射到ATF3KO小鼠(每只小鼠3×108PFU剂量)。为提高这个方法特异性,从ATF3KO小鼠中分离GFP+心脏成纤维细胞和GFP+心肌细胞,发现ATF3蛋白在心脏成纤维细胞中显着增加,但在心肌细胞中仅略有增加。ATF3KO小鼠给予LV-对照,LV-Con-mir1/133TS或LV-ATF3-mir1/133TS,随后AngII输注7天。7天后,收集心脏组织进行组织病理学检查并分离出心脏成纤维细胞,发现ATF3在LV-ATF3-mir1/133TS转导的ATF3KO小鼠心脏组织中显著上调。总而言之,这些数据显示了ATF3KO小鼠表型可被miRNA辅助/慢病毒介导的成纤维细胞ATF3过表达成功实现心脏拯救。

第三种——获得性功能方法。研究者构建了条件性心脏成纤维细胞特异性ATF3-转基因小鼠模型(ATF3fl / flTG)。 ATF3fl / flTG)小鼠与诱导型成纤维细胞特异性Cre小鼠(col1a2-Cre/ERT)杂交。腹腔注射他莫昔芬激活基因表达。为了评估转基因渗漏,我们检测了Col1a2和ATF3在心脏,肝脏,肺,肾脏,脾脏和血管中的表达。高表达Col1a2仅在心脏和血管中观察到,肾脏中低表达,而在其他器官中无显著差异。ATF3在ATF3fl / flTGCre- 或WT小鼠的所有器官中都无显著性差异。在ATF3fl/ flTGCre+小鼠中,ATF3表达水平仅在心脏和血管中显着升高,肾脏中轻微升高,在其他器官中没显著性差异。与ATF3fl/flTGCre-小鼠相比,源自ATF3fl/flTG Cre +小鼠心脏成纤维细胞中ATF3 的转录水平显着上调(而心肌细胞中没有显著差异)。使用谱系追踪技术,确定了Col1a2与Col1a1(心脏成纤维细胞),CD31(内皮细胞),SM22(平滑肌细胞)和Col2a1(瓣膜细胞)共定位。Col1a2+细胞与Col1a1阳性细胞存在共定位,与CD31,SM22或Col1a1阳性细胞则不存在这类现象。双重免疫荧光染色显示在ATF3fl/flTGCre +小鼠中ATF3主要表达于Col1a1 +或Col1a2 +心脏成纤维细胞。总之,这些数据表明Col1a2 +细胞是心脏成纤维细胞的特异性细胞,ATF3在ATF3fl/flTGCre +小鼠心脏成纤维细胞中特异性表达。

为了研究ATF3过表达对心脏重塑的影响,分别注射他莫昔芬Cre +、ATF3fl/flTGCre-和ATF3fl/flTGCre+小鼠,然后再分别用盐水或Ang II输注12周。结果发现:与Cre +、ATF3fl/flTGCre-小鼠相比,ATF3fl/flTGCre +小鼠的心脏成纤维细胞中ATF3蛋白质表达显着上调。Ang II诱发的整体和微观病理变化在ATF3fl/flTGCre+小鼠中显着减弱;具体来说,心脏体积变小;左心室扩张减缓;心脏纤维化减轻。此外,心肌细胞横截面积显著变小。与Cre +、ATF3fl/flTGCre-小鼠相比,ATF3fl/flTGCre +小鼠的心脏成纤维细胞中ANP和Myh7的mRNA水平显著降低。最后,Ang II输注的ATF3fl / flTGCre +小鼠中心功能明显改善,心室扩张明显降低。

第四种——骨髓移植。与盐水对照相比,Ang II输注将适度增加巨噬细胞ATF3表达,下面进一步确定Ang II输注后巨噬细胞ATF3表达是否有助于心脏保护。我们进行了BM移植(BMWT ——ATF3KO或者BMATF3KO ——WT小鼠),然后Ang II输注28d。结果发现:与BMWT ——WT小鼠相比,BMWT ——ATF3KO小鼠中ATF3表达水平显著下调,而在BMATF3KO ——WT小鼠中ATF3表达则无显著性差异。更重要的是,不论BM什么来源(BMWT还是BMATF3KO),ATF3KO 受体小鼠都表现出更严重的心室重塑(心脏纤维化和肥大增强)。相比之下,不论BM什么来源(WT或ATF3KO),WT受体小鼠都没有表现出严重的心室重塑。

 

4、ATF3如何抑制靶基因Map2K3介导的心脏保护作用(ATF3的分子机制研究)?

为了探索ATF3如何调节心室重塑,采用两种策略进行鉴别Map2K3调控基因(负责ATF3-Map2K3下游信号传导)。

首先,从Ang II输注的WT或ATF3KO小鼠中分离成纤维细胞,并进行转录组检测(RNA-seq)寻找下游靶标,结果发现701个上调基因,468下调基因(筛选标准:FDR <0.05;倍数变化> 1.2)。为验证RNA-Seq数据的准确性,随机选择10个差异基因进行qRT-PCR验证,发现RNA-Seq和qRT-PCR结果之间可达到90%的吻合度。ATF3KO心脏成纤维细胞差异表达基因多与纤维化,肥大和炎症相关。通路富集分析显示,上调信号通路与高血压心脏重塑密切相关,特别是ECM沉积(局灶粘连和ECM-受体相互作用);肥大(胰岛素,MAPK和mTOR信号)和炎症(细胞因子-细胞因子受体相互作用和白细胞跨膜迁移)。最后,根据47个显著性通路及其相互作用构建Path-Net网络分析,来确定ATF3介导的保护作用中最核心的信号通路。分析结果发现:在ATF3KO细胞中MAPK信号通路基因表现出最大富集度。

其次,从ATF3KO小鼠中分离心脏成纤维细胞,并分别转染ATF3过表达(Ad-ATF3)或空(Ad-con)腺病毒两种载体,然后进行Ang II体外刺激。在转染细胞中证实ATF3表达上调后,进行ATF3 CHIP-seq实验。我们选择性鉴定出在ATF3过表达的心脏成纤维细胞中高度富集的727个ATF3靶基因。为了进一步缩小ATF3介导基因范围,我们进行了两层生物信息学分析:1)WT和ATF3敲除成纤维细胞转录组的差异基因中与ATF3靶标基因相的;2)用分别转染有Ad-con和Ad-ATF3的ATF3敲除成纤维细胞进行ATF3 ChIP测序,两者的差异基因用于ATF3结合基因进一步筛选。最后筛选出31个基因——被鉴定为直接与ATF3结合的靶标基因。结合这两个策略的结果,我们集中在MAPK通路基因。ChIP-seq分析表明Map2K3上存在有显著性的ATF3结合启动子区域。独立CHIP测序也证实Map2K3的富集水平显著高于正常IgG。有趣的是,Map2K3转录水平在ATF3KO心脏成纤维细胞中表达显著上调,而在Ad-ATF3转染的心脏成纤维细胞中表达显著下调,这表明该转录因子抑制,而不是刺激Map2K3表达。与体外研究结果一致,Map2K3转录和蛋白水平在Ang II注射的ATF3KO小鼠心脏成纤维细胞中显着上调;而在ATF3fl/flTGCre +小鼠心脏成纤维细胞中的表达降低。

为了在ATF3KO动物中进一步确定Map2K3上调与高血压心脏重塑恶化之间的因果关系,研究者进行了一些功能验证实验。分离出心脏成纤维细胞,并用Ang II体外处理。与对照相比,Ang II诱导的a-SMA和胶原蛋白I在心脏成纤维细胞中的表达水平更胜于ATF3KO小鼠(图7A)。在ATF3KO心脏成纤维细胞中,抑制Map2K3(表达Map2K3 shRNA的慢病毒——LV-Map2K3-shRNA)可以显著降低Ang II诱导的D-SMA和胶原蛋白I的表达。心脏成纤维细胞通过旁分泌调节心肌细胞。接下来,将心肌细胞与分离自ATF3KO小鼠的心脏成纤维细胞共同培养,发现Map2K3可抑制Ang II诱导发生的心肌细胞肥大作用。用LV-Map2K3-shRNA基因抑制Map2K3可显着抑制Ang II诱导的ANP表达和降低心肌细胞大小。

以上结果都表明ATF3抑制Map2K3基因表达,接下来进一步研究ATF3抑制Map2K3转录的潜在分子机制。通过PPI网络分析证明ATF3与组蛋白脱乙酰酶(HDAC)的相互作用。Co-IP检测结果也表明HDAC1确实存在于ATF3-免疫沉淀复合物中。最重要的是,Map2K3结合组蛋白乙酰化蛋白(H4ac)的启动子区域在Ang II诱导心脏成纤维细胞中显着富集增加,而在ATF3过表达时显着减少。

 

5、p38 MAPK激活介导ATF3缺失诱导的纤维化和低血压。

Map2K3通过激活p38 MAPK实现不同的生物学功能。结果表明p38及其下游靶点MAPK激活的蛋白激酶2的磷酸化水平在分离自Ang II输注的ATF3KO小鼠心脏成纤维细胞中显著增加。而与TGCre小鼠相比,ATF3fl/flTGCre+小鼠的p38磷酸化水平在心脏成纤维细胞中显著降低。这些数据表明ATF3可能通过抑制Map2K3表达,进一步抑制p38,从而抑制高血压重塑。我们进行了补充实验,以验证以上结果。首先,将心肌细胞与从ATF3KO动物分离的心脏成纤维细胞共培养,发现p38抑制显著降低Ang II诱导的ANP 转录水平和心肌细胞大小,这与Map2K3基因抑制的结果相似。鉴于TGF-β在心脏重塑发挥作用的广泛认知,以及辅以高通量二代测序实验结果发现的p38抑制后3个关键下调信号通路(RNA-seq+通路富集分析),表明ATF3KO小鼠中p38抑制作用依赖于Ang II激活的TGF-β信号通路。qRT-PCR结果表明:ATF3缺陷的心脏成纤维细胞中TGF-β通路相关基因(包括Tgfb2,BMP4,Thbs2,Thbs3,Col1a1,Col3a1,Igf1,Itgb5和Igfbp5)的表达水平显着上调;而在p38抑制后则被抑制。目前已知TGF-β介导纤维化和心肌细胞肥大相关的多种信号分子(包括IL-6,内皮素-1,FGF2和磷酸化Smad3)在Ang II输注处理ATF3缺陷的心脏成纤维细胞中都显著增加。这些作用在p38抑制后消除。

为了进一步确定以上结果,我们进行了跨物种验证。对来自5个HCM患者的心脏组织(HCM患病组)和4个正常组织(正常组)进行转录组检测;同时对p38抑制剂预处理的Ang II诱导心脏成纤维细胞(p38+Ang II组)和未用p38抑制剂预处理的Ang II诱导心脏成纤维细胞(con+Ang II组)进行转录组检测。HCM患病组和正常组比较结果发现970个上调基因和829个下调基因(筛选标准:p <0.05,倍数变化> 1.5)。通路富集分析发现了HCM中七个最显着的上调通路,包括ECM受体相互作用,局灶粘连,肌动蛋白细胞骨架调节,肥厚性心肌病,扩张性心肌病,TGF-β信号通路,致心律失常性右心室心肌病。在p38抑制剂治疗后,心肌成纤维细胞中HCM特异性标记显著下调,且63个差异基因表现出相同的调控方向(43个基因上调,20个基因下调);121个基因表现出相反的调控方向(97个上调基因,24个下调基因)。而且,通路富集分析显示p38抑制后,97个交集下调基因主要富集在7个标志性HCM通路上。

 

研究结论:

总结来说,高血压刺激成纤维细胞中ATF3高表达,它可以通过抑制Map2K3,从而进一步抑制p38-TGF-β传导通路表达来保护心脏。这些结果表明心脏的正调节成纤维细胞ATF3可能代表抗高血压心脏重塑的新型治疗方法。

 

原文转自《生物通》,赛业生物梳理编辑。

 
作者简介——杜杰


首都医科大学附属北京安贞医院,北京市心肺血管疾病研究所副所长


2008年获批教育部“长江学者”特聘教授


杜杰教授整合首都医科大学心血管临床学科与基础学科的优势资源,与国际研究机构合作,建立从实验室到病床直接关联、开创心血管病转化医学的特色研究的新模式。


赛业生物科技简介

cyagen


赛业生物科技集团是全球领先的多元化跨国生物科技实体,2006年成立于美国,中国区总部设立在广州,并在苏州设有子公司,北京、上海、武汉、重庆等地均有办事处。目前员工人数达400余名,总规模超22000平方米,业务经营范围涵盖模式动物、细胞生物学、分子生物学、生物信息学等生命科学领域的多个分支学科。


作为全球领先的转基因/基因敲除模式动物商业技术平台,赛业模式生物研究中心达10000平米,其中包括5000平米的SPF级动物实验室,配备有IVC和EVC饲养设备超过500套,可养殖SPF级大小鼠近30000笼,动物种群规模超过15万只。每年可构建基因敲除鼠、转基因鼠模型10000例以上,学术引用累计超过1200篇,是目前国际上最主要、最被认可的基因工程模式动物商业服务平台之一。自主开发的全球首款功能强大的在线载体设计工具VectorBuilder,每年可定制载体超30万个,彻底颠覆生物技术领域传统格局,打造载体构建金标准和新模式。


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