基因表达慢病毒载体介绍

日期: 2017年06月22日


    

基因表达慢病毒载体由慢病毒基因组序列和细菌质粒序列构成。细菌质粒序列含有一个Ampicillin抗性基因和一个高拷贝复制子pUCori。慢病毒基因组序列是从元件5'LTR开始,到元件3'LTR结束。

 

基因表达慢病毒载体

 

慢病毒基因组序列可容纳两个外源基因表达盒子:一个是目的基因表达盒子,另外一个是marker基因表达盒子。Marker基因表达盒子已经克隆在载体上,无需重新构建。我们提供了荧光marker、抗药性marker或者荧光/抗药性双marker供您选择。目的基因表达盒子则包括两部分序列:启动子和目的基因。每次构建载体,只需通过site-specific recomination cloning技术将感兴趣的启动子和目的基因克隆到载体上即可。


1、克隆方法


赛业采用位点特异性重组的克隆方法,将感兴趣的启动子和目的基因克隆到慢病毒骨架上,如下图

 

site-specific recomination cloning

 

一般来说,我们将启动子放在pUp入门克隆上,将目的基因放在pDown入门克隆上。由于我们已建成了一套常用启动子的pUp,因此每次构建时,我们只需构建一个携带目的基因的pDown,再与您选择的启动子和慢病毒骨架载体进行位点特异重组反应则可获得基因表达慢病毒载体。


为什么慢病毒载体所用到的目的基因序列是ORF而非cDNA或基因组序列呢?


慢病毒基因组序列不允许有polyA序列出现,否则会影响病毒包装,而基因组序列往往较长,容易超出病毒的包装能力。我们已经建成了常用报告基因的ORF库、人和小鼠蛋白编码基因的ORF库。您可以登陆www.vectorbuilder.com选择感兴趣的报告基因、人和小鼠的蛋白编码基因进行载体设计。


为什么慢病毒载体上的外源基因表达盒子不带polyA元件?


在包装过程中,转染进包装细胞的慢病毒载体的功能是转录出HIV RNA基因组。完整的HIV RNA基因组是从5'LTR转录开始到3'LTR结束,基因组中间不能有转录终止元件(如polyA元件),如果有,则生成不了宪整的HIVRNA基因组。


2、质量控制


我们会对每一个pDown上的目的基因片段进行测序验证,序列正确后再进行重组,然后对基因表达慢病毒载体挑克隆,并进行酶切鉴定,酶切鉴定合格后交付.

 

赛业生物提供分子生物学技术服务:

基因调取:中国最大的基因库,小鼠基因2万个,人类基因3万个

载体构建VectorBuilder高通量载体构建平台,2分钟完成在线载体设计

病毒包装慢病毒包装腺病毒包装腺相关病毒包装

 

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