gRNA慢病毒载体介绍

日期: 2017年06月27日


    

gRNA慢病毒载体介绍

 

gRNA慢病毒载体由慢病毒基因组序列和细菌质粒序列构成。细菌质粒序列含有一个Ampicillin抗性基因和一个高拷贝复制子pUCori。慢病毒基因组序列是从元件5'LTR开始,到元件3'LTR结束。


慢病毒基因组序列可容纳两个外源基因表达盒子:一个是gRNA表达盒子,另外一个是marker基因表达盒子。Marker基因表达盒子已经克隆在载体上,无需重新构建。我们提供了荧光marker、抗药性marker或者荧光/抗药性双marker供您选择。gRNA表达盒子则包括三部分序列:U6启动子、gRNA和终止子。U6启动子已经克隆在载体上,每次构建载体,只需通过annealing-ligation技术将感兴趣的gRNA打靶序列克隆到载体上即可。gRNA打靶序列与gRNA scaffold序列构成一个完整的gRNA。


1、克隆方法


赛业采用引物退火连接的克隆方法,将gRNA克隆到慢病毒骨架上。


我们的gRNA慢病毒载体使用了human U6 promoter转录gRNA。 gRNA被Cas9蛋白识别,与基因组序列结合,从而引起Cas9蛋白对基因组序列的剪切。gRNA靶序列与目标基因DNA序列的匝配程度决定了gRNA的切割效率,而gRNA靶序列与其他目的基因DNA序列的匹配程度决定了gRNA的脱靶效应。gRNA靶序列的选择还遵循PAM序列的规则。我们建立了人的gRNA靶序列信息库,小鼠和大鼠的gRNA靶序列信息库也即将推出。您可以登陆www.vectorbuilder.com选择感兴趣的人、小鼠和大鼠的gRNA进行载体设计。


CRISPR慢病毒系统


CRISPR慢病毒系统包括两个载体:


1) gRNA慢病毒载体


2) Cas9慢病毒载体


Cas9慢病毒载体利用CBh启动子共表达humanized Cas9基因和Hygromycin抗药性基因。gRNA慢病毒载体利用U6 promoter表达gRNA,同时携带了一个表达抗药性基因的基因表达盒子。在设计gRNA慢病毒载体时,请选择非Hygromycin抗药性基因(Puromycin、Neomycin和Blasticidin),两个载体需要不同的抗药性基因配套使用才能起到药筛的效果。


2、质量控制


我们会对每一个gRNA慢病毒载体挑克隆,并测序gRNA片段。测序正确后,再进行酶切鉴定,酶切鉴定合格后交付。

 

赛业生物提供分子生物学技术服务:

基因调取:中国最大的基因库,小鼠基因2万个,人类基因3万个

载体构建VectorBuilder高通量载体构建平台,2分钟完成在线载体设计

病毒包装慢病毒包装腺病毒包装腺相关病毒包装

 

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