重组腺病毒包装服务介绍

日期: 2017年07月04日


    

腺病毒包装系统


赛业生物采用第1代重组腺病毒包装系统制备腺病毒颗粒,该包装系统包含1个腺病毒载体和l株包装细胞株。


1)1个腺病毒载体:含有缺失了E1和E3基因的腺病毒基因组序列的质粒。


2)l株包装细胞株:表达El基因的293细胞。


野生型腺病毒基因组是一条约36 kb的线性双链DNA (dsDNA)分子。基因组的两个末端被称为Inverted Terminal Repeat (ITR),末端之间含有腺病毒DNA复制所需基因。在病毒DNA复制周期早期表达的基因,称为早期基因,主要有4个,按表达先后顺序依次是E1、E2、E3、E4。在病毒DNA复制周期晚期表达的基因,称为晚期基因,主要有5个,按表达先后顺序依次为Ll、L2、L3、L4、L5。为了制备出自我失活的重组腺病毒,E1基因会被删除,使重组腺病毒成为一种安全的基因运输工具。为了增加包装能力,E3基因也同时被删除,因为E3基因产物会提高宿主的免疫反应,而且对病毒生产不重要。缺失了E1和E3基因的腺病毒基因组序列被克隆到质粒上构建成腺病毒载体。El基因片段被整合到293细胞基因组中,包装病毒颗粒时,Pacl消化的腺病毒载体转梁到表达E1基因的293细胞。El基因激活了其他早期基因和晚期基因的表达,这些基因表达产物和Pacl消化的质粒DNA组装成病毒颗粒。

 

重组腺病毒包装系统


腺病毒生产

 

生产携带目的基因的重组腺病毒颗粒,过程如下图:

 

重组腺病毒颗粒


将环形腺病毒载体通过Pacl位点酶切后获得两末端是ITR序列的线性双链DNA,再转染线性化DNA到包装细胞。线性化双链DNA分饰两个角色,既是病毒基因组,又是病毒蛋白表达所参照的基因模板序列。基因组与病毒蛋白组装成病毒颗粒,病毒颗粒在细胞内成熟后,使得细胞破裂,从而使病毒颗粒释放到培养液中。然后收集细胞和培养液,反复冻融细胞和培养液的混合物,离心收集上清,获得粗病毒。此时的粗病毒量通常不会很高,一般会将粗病毒感染更多的包装细胞,以扩增病毒量。病毒扩增后,只收集细胞,再反复冻融细胞,离心收集上清,即可获得转导细胞级别的病毒颗粒。如果您想获得注射动物级别的病毒颗粒,可以利用CsC12超速离心进一步去除杂质,从而获得纯度更高的病毒颗粒。


质量控制


我们对每一批病毒都进行滴度检测,严格控制质量,让您百分百放心。针对转导细胞级别的病毒颗粒,我们会采用TCID50滴度检测法。针对注射动物级别的病毒颗粒,我们则采用OD260滴度检测法。


服务明细

 

腺病毒包装服务


为什么腺病毒滴度单位有两种:VP/m和PFU/ml?


VP/mI是基于OD260读数计算出来,Viral particles (VP)代表样品中总的病毒颗粒数量(活的和死的)。PFU通过计算10倍稀释的病毒感染单层293细胞后形成的空斑个数而得来,Plaque Forming Unit (PFU)代表有感染性的病毒。病毒感染293细胞后,病毒会在细胞内扩增。当病毒量到达一定程度,它们会从感染的细胞中释放出来,细胞会破裂,死亡,然后飘起来,释放的病毒进一步感染附近的细胞。病毒感染和释放重复发生直到空斑形成。对大多数病毒制备来说,VP/PFU的比例范围是从5:1到100:1。


赛业生物不仅提供基因表达腺病毒定制服务,还提供shRNA干扰腺病毒定制服务。订制病毒从订制转移质粒开始,登陆www.vectorbuilder.com即可轻松快捷地设计转移质粒!


基因表达腺病毒载体介绍


shRNA干扰腺病毒载体介绍


案例

 

腺病毒案例


什么是CPE现象?


EGFP腺病毒载体转染293A细胞7天后出现CPE现象EGFP腺病毒颗粒转导293A细胞Cytopathic effect (CPE)中文名称叫细胞病变效应,是指宿主细胞由于被腺病毒感染引起的细胞裂解或者细胞死亡,这些细胞会出现变圆和飘起来等细胞形态变化。

 

赛业生物提供分子生物学技术服务:

基因调取:中国最大的基因库,小鼠基因2万个,人类基因3万个

载体构建VectorBuilder高通量载体构建平台,2分钟完成在线载体设计

病毒包装慢病毒包装腺病毒包装腺相关病毒包装

 

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