Immunity:Treg细胞识别的天然抗原表位揭示免疫机制

日期: 2017年08月03日


    

导读

表达Foxp3的调节T(Treg)细胞对于预防自体免疫、抑制抗肿瘤免疫是一种关键的细胞。Treg细胞识别的主要自体抗原仍未确定,成为研究免疫调节的重要障碍。来自芝加哥大学的Leonard等人鉴定了小鼠前列腺中的天然Treg细胞配体,其方法可作为一种策略用于寻找与人类自体免疫病相关的Treg细胞抗原,从而揭示导致自体免疫的机制,和发展性癌症中Treg如何被利用来抑制机体本身的免疫反应。该研究近期发表在顶级免疫学期刊Immunity(IF:24.08)上,本研究使用的Tcaf3基因敲除小鼠由赛业生物采用CRISPR-Pro基因敲除技术制备。


研究背景


免疫系统在响应外来抗原刺激、产生免疫应答的同时,也要限制针对自体抗原的免疫应答。免疫应答过程产生的各种CD4+ T细胞表达独特的T细胞受体(TCR),能特异识别由抗原呈递加工产生的抗原MHC-II复合物;但是需要经过两个关键途径先将其中会与自体反应的那些CD4+ T细胞清除掉,否则产生的自体反应将是非常可怕的。这两个重要的耐受机制就是阴性筛选和调节性T细胞生成,前者能够从常规T细胞库中清除掉能与自体pMHC-II反应的T细胞群或者将其转化为类初始T细胞系,后者通过将一些过度自反应T细胞转化为表达转录因子Foxp3的调节性T细胞(Treg),以抑制那些逃过阴性筛选的自反应T细胞,从而限制对自体组织的应答,维持免疫稳态。


要了解机体如何调控Treg细胞的分化、平衡和抑制活性,就需要鉴别出哪些分子启动胸腺中Treg细胞发育、哪些分子参与Treg细胞在外周环境中识别自体抗原以协调免疫抑制。可惜,胸腺来源的Treg(tTreg)的天然抗原一直未能确定。


找出Treg细胞识别的内源性抗原意义重大。如果找不到这些能启动Treg在胸腺里分化的天然自体抗原,就无法全面认识Treg细胞介导的免疫抑制为何在自体免疫疾病和炎性疾病中失灵,更无法回答在发展性癌症中Treg细胞是如何被利用来抑制机体本来的抗肿瘤免疫性。


如果能找到这些抗原,就能从形态,频率,结构定位和谱库等角度去分析Treg细胞如何响应这些抗原;了解这种识别是否需要特定的生化或者结构特征(而这些信息有助于了解其抑制机制);有助于清晰阐明为何部分自体反应T细胞被清除掉而部分则被引导转化为Treg细胞系,这种TCR-pMHC-II结合是否会是决定T细胞不同命运的主要因素;以及考虑到机体内潜在如此大量的自体多肽,防止组织遭受自体免疫攻击是否依赖于能与某些特定自体pMHC-II复合物反应的Treg细胞等等。


来自芝加哥大学的研究人员鉴别出了两个前列腺特异Treg细胞克隆所识别的多肽抗原—— 一种Treg细胞在小鼠前列腺肿瘤中大量存在,另一种Treg细胞与前列腺自体免疫损伤相关。巧的是,这两个多肽抗原来自同一个前列腺特异蛋白的不同部位,而这个前列腺特异蛋白在多个小鼠自体免疫病模型中往往是免疫失调中向抗体攻击的靶子。这种关联为深入了解Treg细胞介导的耐受提供了线索,其研究策略可作为一种参考策略用于鉴别其他的人和小鼠Treg细胞识别的抗原。


研究方法


研究人员最初把目标锁定在此前研究中发现的小鼠前列腺损伤自然产生的Treg细胞克隆MJ23,想方设法鉴别出其识别的pMHC-II配体中对应的那个未知抗原。


怎么分析这些蛋白呢?研究人员设计了一种抗原活性筛选方法:建立表达MJ23 TCR受体的转基因T细胞(MJ23tg T细胞),用体外培养系统来监测其增殖活性。用这个方法,研究人员发现将前列腺背外侧叶蛋白提取物与脾源树突状细胞(splenic dendritic cells)共培养后,能够诱导MJ23tg T细胞的增殖,说明MJ23相关肽能够被分离,并用这个方法监测到。


这个未知抗原(姑且称为MJ23相关肽抗原)的MHC-II复合物是通过与MJ23 TCR受体作用,以自体免疫调节因子(Aire)依赖的方式启动胸腺里的Treg细胞发育。通过各种考据分析,研究人员推测这个MJ23肽抗原应该满足3个标准:包含该肽段的蛋白应该主要在前列腺表达;在髓质胸腺上皮细胞中编码该蛋白的基因应该是Aire的一个转录靶标;该基因不在Y染色体上(因为在雌性小鼠中MJ23tg Treg细胞同样发生这种分化)。通过转录图谱分析,研究人员筛选出满足上述条件的20个潜在基因,并在昆虫细胞中表达这些蛋白。


将培养的树突状细胞与上述表达的蛋白共培养,发现其中TRPM8通路相关因子3(Tcaf3,也叫Eapa2或者Fam115e)能够在体外强烈诱导刺激MJ23tg T细胞。这种刺激能够被抗MHC-II阻断抗体所阻断,且Tcaf3不会诱导无关类型的转基因T细胞。用重组Tcaf3免疫注射活体小鼠能引发MJ23tg T细胞的强烈增殖,说明Tcaf3来源的肽段能够在活体内被有效地加工呈递。通过肽段分析能与这些小鼠内唯一功能性MHC-II蛋白I-A(b)结合的肽段,最后确定出Tcaf3的646-658肽段为被MJ23tg T细胞识别的肽段表位。


关键实验


但是我们知道,体外实验结果跟体内并非一回事儿,特别是免疫学研究,体外实验无法模拟复杂的活体免疫反应,活体动物实验才是“检验真理的唯一标准”。


所以芝加哥大学的研究人员委托赛业生物公司制备了Tcaf3(646–658)13mer肽段缺失(基于CRISPR/Cas9方法)的基因敲除小鼠Tcaf3(tm1/tm1)以进行活体研究。为验证这个肽段表位是否为活体中MJ23 Treg细胞发育的驱动因子,作者从MJ23tg Rag1-/-雌鼠中分离不含Foxp3+细胞的T细胞,通过注射将其转移到基因敲除小鼠和对照小鼠中。在正常对照小鼠中,供体MJ23tg T细胞分化为Foxp3+细胞,而在Tcaf3(tm1/tm1)基因敲除小鼠中则无法发生。Tcaf3(tm1/tm1)基因敲除小鼠的前列腺提取物不能在体外刺激MJ23tg T细胞,均证实Tcaf3(646–658)的特异性作用——是Treg细胞群识别的天然抗原表位,没有它就不能触发MJ23tg T细胞分化为Foxp3+的Treg细胞。在胸腺中这种组织特异性的Treg细胞克隆的发育需要单一个自体肽在胸腺中的表达。


另一个前列腺相关Treg细胞克隆的内源性肽抗原


作者尝试用同样的策略来再分析其他Aire依赖的前列腺相关Treg细胞以鉴别其肽抗原。与前列腺自体免疫损伤相关的SP33是一个丰度高的Aire依赖/前列腺相关Treg细胞株。采用相似的策略筛选,结果又是Tcaf3!肽段分析表明Tcaf3(88-107)是SP33TCR受体识别的抗原肽段。


小鼠Tcaf3是一个未知功能的102kD蛋白,主要在小鼠前列腺背外侧叶和前叶表达。此前有多个研究表明Tcaf3是前列腺自体免疫病小鼠模型中自向抗体的攻击靶标。


作者又做了一个研究。用Tcaf3(646–658)肽和完全弗氏佐剂处理健康雄性小鼠以扩增T细胞,14天后磁性筛选富集脾脏和淋巴结的Tcaf3/I-A(b)-tetramer+细胞并用双荧光标记。另外用I-A(b)限制的外源多肽2W1S作为对照。Tcaf3/I-A(b)-tetramer+细胞中64%表达Foxp3(Treg细胞重要的转录调控子和标志物),表明Tcaf3(646–658)特异T细胞多数发育为Treg细胞。作为对照的2W1S/I-Ab处理小鼠得到的2W1S/I-Ab-tetramer+细胞中只有少数表达Foxp3。


另外,实验表明,在Aire+/+小鼠中许多T细胞能被转化为Treg细胞系,而在Aire-/-小鼠中则被转为致病性的Tconv细胞。而Aire-/-缺陷小鼠用同样方法处理Tcaf3/I-A(b)-tetramer+细胞只有少数表达Foxp3的细胞,多数转化为Tconv细胞。结果显示Aire通路在引导MJ23T细胞发育为Treg细胞系过程中的作用。


总结


前面说过要研究Treg在自体免疫失调和发展性癌症中的作用,需要先找到其识别的内源性抗原。文章作者成功找到了两种Treg细胞株对应的内源性抗原并证明其作用,为进一步研究Treg机制的秘密提供了一种可作为策略性的方法。研究癌症几十年来,大量的经费投入癌症研究,也发表了不计其数的论文,但是发展性癌症的治疗情况仍然没有显著改善,许多研究人员又将重点投向免疫机制的研究,期望以免疫系统的多变性对付癌细胞的多变性。解开Treg的机制将为这个目标带来新的希望。

赛业生物科技简介

cyagen


赛业生物科技集团是全球领先的多元化跨国生物科技实体,2006年成立于美国,中国区总部设立在广州,并在苏州设有子公司,北京、上海、武汉、重庆等地均有办事处。目前员工人数达400余名,总规模超22000平方米,业务经营范围涵盖模式动物、细胞生物学、分子生物学、生物信息学等生命科学领域的多个分支学科。


作为全球领先的转基因/基因敲除模式动物商业技术平台,赛业模式生物研究中心达10000平米,其中包括5000平米的SPF级动物实验室,配备有IVC和EVC饲养设备超过500套,可养殖SPF级大小鼠近30000笼,动物种群规模超过15万只。每年可构建基因敲除鼠、转基因鼠模型10000例以上,学术引用累计超过1200篇,是目前国际上最主要、最被认可的基因工程模式动物商业服务平台之一。自主开发的全球首款功能强大的在线载体设计工具VectorBuilder,每年可定制载体超30万个,彻底颠覆生物技术领域传统格局,打造载体构建金标准和新模式。


2009年,赛业通过ISO9001:2008认证并于2012年顺利通过复审,确保向广大专家学者提供的所有产品和技术服务符合国际标准。AAALAC认证的顺利通过,使赛业成为华南地区极少数个获得国际实验动物评估和认可委员会国际认证的单位之一。这不仅是实验动物质量和生物安全水准的象征,更是国际前沿医学研究的质量标志。


赛业公司目前在美国加州Santa Clara 建立起活体实验鼠检测、隔离中心,成为国内唯一一家具有活体实验鼠类出口能力的生物企业;通过国家出入境检验检疫部门的考核,成为华南地区第一家生物材料出入境绿色通道试点单位,加速了实验动物出入境审批流程,并进一步提升了赛业模式动物中心国际服务的能力。


目前公司的产品和技术服务已为全球数百个顶尖生命科学实验室和跨国制药公司提供了帮助,秉承着“为生物科技创造无限可能”的企业愿景服务于全世界的科研学者!

 

赛业生物微信

  • 侧边栏广告 - 模式动物成功案例
  • 侧边栏广告 - 科研奖励基金计划
  • 侧边栏广告-积分兑换礼品