CRISPR慢病毒包装

CRISPR慢病毒包装

CRISPR/Cas9慢病毒系统可对基因组的特定位点进行精确编辑。其原理是核酸内切酶Cas9蛋白通过导向性RNA(guide RNA,gRNA)识别特定基因组位点并对双链DNA进行切割,从而实现细胞水平单基因或多基因敲除。CRISPR慢病毒缩短实验周期的同时,更能快速得到实验结果,省时省力。

 

每次包装重组慢病毒,包装质粒和编码包膜蛋白的质粒都是固定不变的,变的是编码目的基因的转移质粒。因此,您需要设计的是转移质粒。登陆www.vectorbuilder.com即可轻松快捷设计转移质粒!

“慢病毒包装”

 

慢病毒生产

生产携带目的基因的重组慢病毒颗粒,过程如下图:

首先将转移质粒、包装质粒和包膜蛋白质粒转染到293T细胞。更换新鲜的培养基后,继续培养48~72小时。收集培养液,进行离心浓缩后,就可得到转导细胞级别的病毒颗粒。如果您想获得注射动物级别的超纯病毒颗粒,可以利用蔗糖超速离心进一步去除杂质,从而获得纯度更高的病毒颗粒。

 

质量控制

我们会对每一批病毒都进行滴度检测,严格控制质量,让你百分百放心。针对用携带荧光报告基因的转移质粒生产的病毒,我们会先用荧光法检测病毒的转导率,如能达到使用要求,再进一步采用qPCR法检测病毒滴度。

 

服务明细

“慢病毒生产”/

 

赛业生物不仅仅提供基因表达慢病毒定制服务,还提供shRNA干扰慢病毒和gRNA慢病毒定制服务。您可根据实验需要,选择一款适合于您的重组慢病毒来开展基因功能研究工作。订制病毒从订制转移质粒开始,登陆www.vectorbuilder.com即可轻松快捷地设计转移质粒!

 

慢病毒载体

gRNA慢病毒载体

“服务明细”

 

gRNA慢病毒载体由慢病毒基因组序列和细菌质粒序列构成。细菌质粒序列含有一个Ampicillin抗性基因和一个高拷贝复制子pUCori。慢病毒基因组序列是从元件5’LTR开始,到3’LTR结束。


慢病毒基因组序列可容纳两个外源基因表达盒子:一个是目的基因表达盒子,另外一个是marker基因表达盒子。Marker基因表达盒子已经克隆在载体上,无需重新构建。我们提供了荧光marker、抗药性marker或者荧光/抗药性双marker供您选择。gRNA表达盒子则包括三部分序列:U6启动子、gRNA和终止子。U6启动子已经克隆在载体上,每次构建载体,只需通过annealing-ligation技术将感兴趣的gRNA打靶序列克隆到载体上即可。gRNA打靶序列与gRNA scaffold序列构成一个完整的gRNA。

 

1. 克隆方法

我们采用引物退火连接的克隆方法,将gRNA克隆到慢病毒骨架上。

我们的CRISPR/Cas9慢病毒载体使用了human U6 promoter转录gRNA。gRNA被Cas9识别,与基因组序列结合,从而引起Cas9对基因组序列的剪切。剪切效率取决于gRNA 是否只与目标基因组序列特异性100%匹配。目标序列的选择还需要考虑下游有PAM特征的序列。您可以登陆vectorbuilder.com选择感兴趣的人、小鼠和大鼠的gRNA进行载体设计。

 

Tips

CRISPR慢病毒系统

CRISPR慢病毒系统包括两个载体:

1)gRNA慢病毒载体

2)Cas9慢病毒载体

Cas9慢病毒载体利用CBh启动子共表达humanized Cas9基因和Hygromycin抗药性基因。gRNA慢病毒载体利用U6 promoter表达gRNA,同时携带了一个表达抗药性基因的基因表达盒子。在设计gRNA慢病毒载体时,请选择非Hygromycin抗药性基因(Puromycin、Neomycin和Blasticidin),两个载体需要不同的抗药性基因配套使用才能起到药筛的效果。

 

2、 质量控制

我们会对每一个CRISPR/Cas9慢病毒载体挑克隆,并测序gRNA片段。测序正确后,再进行酶切鉴定,酶切鉴定合格后交付。

 

病毒包装服务