腺病毒包装

腺病毒包装

赛业生物采用第1代重组腺病毒包装系统制备腺病毒颗粒。该包装系统包含一个腺病毒载体和一株包装细胞株。
1、一个腺病毒载体:缺失了E1和E3区域的腺病毒基因组序列被克隆到质粒上。
2、一株包装细胞株:E1基因片段被整合到293细胞。

 

野生型腺病毒基因组是一条约36kb的线性双链DNA(dsDNA)分子。基因组的两个末端被称为Inverted Terminal Repeat(ITR),末端之间含有腺病毒DNA复制所需基因。在病毒DNA复制周期早期表达的基因,称为早期基因,主要有4个,按表达先后顺序依次是E1、E2、E3、E4。在病毒DNA复制周期晚期表达的基因,称为晚期基因,主要有5个,按表达先后顺序依次为L1、L2、L3、L4、L5。为了制备出自我失活的重组腺病毒,E1基因会被删除,使重组腺病毒成为一种安全的基因运输工具。为了增加包装能力,E3基因也同时被删除,因为E3基因产物会提高宿主的免疫反应,而且对病毒生产不重要。缺失了E1和E3基因的腺病毒基因组序列被克隆到质粒上构建成腺病毒载体。E1基因片段被整合到293细胞基因组中,包装病毒颗粒时,Pacl消化的腺病毒载体转染到表达E1基因的293细胞。E1基因激活了其他早期基因和晚期基因的表达,这些基因表达产物和Pacl消化的质粒DNA组装成病毒颗粒。

 

 

腺病毒生产

生产携带目的基因的重组腺病毒颗粒的过程如下示意图:

 

将环形腺病毒载体通过PacI位点酶切后获得两末端是ITR序列的线性双链DNA,再转染线性化DNA到包装细胞。线性化双链DNA分饰两个角色,既是病毒基因组,又是病毒蛋白表达所参照的基因模板序列。病毒蛋白与基因组组装成病毒颗粒,病毒颗粒在细胞内成熟后,会使得细胞破裂,从而使病毒颗粒释放到培养液中。收集细胞和培养液,然后反复冻融细胞和培养液的混合物。离心收集上清,获得粗病毒。此时的粗病毒量通常不会很高。一般会将粗病毒感染更多的包装细胞,以扩增病毒量。病毒扩增后,只收集细胞。再反复冻融细胞,离心收集上清,即可获得转导细胞级别的病毒颗粒。如果您想获得注射动物级别的病毒颗粒,可以利用CsCl2超速离心进一步去除杂质,从而获得纯度更高的病毒颗粒。

 

质量控制

我们对每一批病毒都进行滴度检测,严格控制质量,让您百分百放心。针对转导细胞级别的病毒颗粒,我们会采用TCID50滴度检测法。针对注射动物级别的病毒颗粒,我们则采用OD260滴度检测法。

 

服务明细

 

腺病毒载体

(一)基因表达腺病毒载体

 

基因表达腺病毒载体由腺病毒基因组序列和细菌质粒序列构成。细菌质粒序列含有一个Ampicillin抗性基因和一个高拷贝复制子pUCori。腺病毒基因组序列是从元件5’ITR开始,到元件3’ITR结束。

腺病毒基因组序列可容纳一个外源基因表达盒子,即目的基因表达盒子。目的基因表达盒子包括三部分序列:CMV启动子、目的基因和polyA。CMV启动子和polyA已经克隆在载体上,每次构建载体,只需通过site-specificrecominationcloning技术将感兴趣的目的基因序列克隆到载体上即可。

 

1、克隆方法

我们采用位点特异性重组的克隆方法,将目的基因克隆到腺病毒骨架上。如下图:

 

一般来说,将目的基因放在pDown入门克隆上。每次构建,我们只需构建一个携带目的基因的pDown,再与携带了CMV启动子的腺病毒骨架载体进行位点特异重组反应就可获得基因表达腺病毒载体。

 

2. 质量控制

我们会对每一个pDown进行目的基因片段测序,序列正确后再进行重组。然后对基因表达慢病毒载体挑克隆,并进行酶切鉴定。酶切鉴定合格后交付。

 

(二)shRNA干扰腺病毒载体

 

shRNA干扰腺病毒载体由腺病毒基因组序列和细菌质粒序列构成。细菌质粒序列含有一个Ampicillin抗性基因和一个高拷贝复制子pUC ori。腺病毒基因组序列是从元件5’ITR开始,到元件3’ITR结束。

腺病毒基因组序列可容纳两个外源基因表达盒子:一个是shRNA表达盒子,另外一个是marker基因表达盒子。Marker基因表达盒子已经克隆在载体上,无需重新构建。我们提供了EGFP和mCherry两种荧光marker供您选择。shRNA表达盒子则包括三部分序列:U6启动子、shRNA和终止子。U6启动子和Marker基因表达盒子已经克隆在pDown入门克隆上,每次构建载体,只需通过annealing-ligation技术将感兴趣的shRNA和终止子克隆到pDown载体上,再通过site-specific recomination cloning技术将pDown入门克隆克隆到载体上即可。

 

1、克隆方法

我们采用引物退火连接和位点特异重组的克隆方法,将shRNA克隆到腺病毒载体上。

我们的shRNA干扰慢病毒载体使用了human U6 promoter转录shRNA。shRNA再体内被剪切成21nt的单链siRNA,21nt的单链siRNA与mRNA互补引起mRNA的降解。干扰效率决定于21nt的单链siRNA是否只与目标mRNA特异性100%匹配。您可以通过www.vectorbuilder.com选择感兴趣的人、小鼠和大鼠的shRNA进行载体设计。

 
2、质量控制

我们会对每一个shRNA干扰腺病毒载体进行挑克隆,并测序shRNA片段。正确后,再进行酶切鉴定,酶切鉴定合格后交付。

 

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