CRISPR-Pro基因敲除/敲入鼠

CRISPR/Cas9基因敲除/敲入鼠

CRISPR-Pro技术原理

Cas9/gRNA复合物在靶位点进行切割,产生双链断裂(DSBDouble-strand break),迫使细胞进行紧急修复。通常条件下,细胞偏向于使用非同源末端连接(NHEJnonhomologous DNA end joining)的方式对断裂的双链进行修复,进而造成靶位点基因的插入/缺失突变。CRISPR-Pro独特的受精卵处理方式,极大地提高了同源重组修复(HDRHomology-directed recombination or repair)路径的效率,使得DNA大片段敲入(KI)及条件性敲除(cKO)得以实现。

 

CRISPR-Pro技术优势

1)周期短,效率高;

2)高嵌合率,生殖遗传稳定;

3)可实现DNA大片段敲入(长达10Kb);

4)可实现条件性敲除(长达4kb);

5)可实现大片段敲除(长达20kb)。

 

Jackson Lab CRISPR/Cas9基因编辑效率 VS Cyagen CRISPR-Pro基因编辑效率

***与Jackson Lab展示的CRISPR/Cas9基因编辑效率相比,赛业生物(CyagenCRISPR-Pro在敲入片段长度与敲入效率方面都更具优势。

 

CRISPR-Pro服务流程与周期

 

CRISPR-Pro基因敲除常用大小鼠模型

完全性基因敲除鼠

CRISPR-Pro完全性基因敲除鼠是通过CRISPR /Cas9基因敲除技术,针对靶基因设计和构建gRNACas9表达质粒,造成目的基因的功能区域被敲除,获得全身所有的组织和细胞中都不表达该基因的小鼠模型。

CRISPR-Pro完全性基因敲除包括:移码突变、片段基因敲除、双/多基因敲除。

 

移码突变鼠的建系原则与流程

1、通过针对靶基因设计、构建相应的gRNA质粒,体外转录为RNA后,与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代杂合子鼠;

2、F0代杂合子鼠与野生型鼠进行交配,获得PCR和测序鉴定阳性的F1代杂合子鼠;

3、选择来自同一只F0代鼠,基因型一致的F1代鼠,达到性成熟后进行互配,可获得F2代鼠。对获得的F2代鼠进行PCR及测序鉴定,理论上,F2代鼠中25%为纯合子,50%为杂合子,25%为野生鼠。

 

 

片段基因敲除鼠的建系原则与流程

1、通过针对靶基因不同位点设计、构建相应的一对gRNA质粒,体外转录为RNA后,与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代杂合子鼠;

2F0代杂合子鼠与野生型鼠进行交配,获得PCR鉴定阳性的F1代杂合子鼠;

3、选择来自同一只F0代鼠,基因型一致的F1代鼠,达到性成熟后互配,可获得F2代鼠。对获得的F2代鼠进行PCR及测序鉴定,理论上,F2代鼠中25%为纯合子,50%为杂合子,25%为野生鼠。

 

双(多)基因敲除鼠的建系原则与流程

1、通过针对两个靶基因分别设计、构建相应的gRNA质粒,体外转录为RNA后,与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代多基因杂合子鼠;

2F0代杂合子鼠与野生型鼠进行交配,获得PCR和测序鉴定阳性的F1代双基因杂合子鼠;

3、选择双基因杂合子鼠进行杂交,获得F2代鼠。对获得的F2代鼠进行PCR及测序鉴定。

 

条件性基因敲除鼠

条件性基因敲除是通过把两个LoxP位点插入到目的基因的一个或几个重要外显子的两端以制备出有两个floxed小鼠。该floxed小鼠在与表达Cre重组酶小鼠杂交之前,该基因表达正常;当floxed小鼠与组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后,可实现在特定的组织或细胞中敲除该基因,而在其它组织或细胞中该基因表达正常。

 

建系原则与流程:

1、与野生型小鼠杂交:阳性CRISPR-Pro小鼠(+/flox)与野生型小鼠(+/+)杂交,获得F1代杂合子小鼠(+/flox);

2、挑选一对F1代杂合子小鼠(+/flox)进行自交,获得F2代纯合子小鼠(flox/flox)。

 

基因敲入鼠

CRISPR-Pro基因敲入鼠是利用CRISPR/Cas9基因敲入技术,针对靶基因设计、构建相应的 gRNA质粒和donor vector,通过Cas9核酸酶的切割作用和同源臂的同源重组,引入特定的突变或外源基因。比如在目的基因上引入点突变(模拟人类遗传疾病模型);或将报告基因(EGFPmRFPmCherrymYFP,或LacZ),从而可以通过报告基因来跟踪目标基因的表达;也可以用报告基因取代大小鼠本身的基因,使KO/KI同时发生。

CRISPR-Pro基因敲入鼠包括:点突变、片段基因敲入。

 

点突变鼠的建系原则与流程

1、通过针对靶基因设计、构建gRNA质粒并转录为RNA,再合成含有突变位点信息的donor oligo,与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代杂合子鼠;

2F0代杂合子鼠与野生型鼠进行交配,获得PCR和测序鉴定阳性的F1代杂合子鼠;

3  选择来自同一只F0代鼠,敲入位点一致的F1代鼠,达到性成熟后进行同胞交配,可获得F2代鼠。对获得的F2代鼠进行PCR及测序鉴定,理论上,F2代鼠中25%为敲入位点一致的纯合子鼠,有50%为只有一条染色体敲入的杂合子鼠,有25%为野生型鼠。

 

片段基因敲入的建系原则与流程

1、通过针对靶基因设计、构建gRNA质粒和含有突变位点信息的donor vector,将以上质粒转录为mRNA后,与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代杂合子鼠;

2F0代杂合子鼠与野生型鼠进行交配,获得PCR鉴定基因型和测序鉴定随机插入的F1代杂合子鼠;

3  选择来自同一只F0代鼠,敲入位点一致的F1代鼠,达到性成熟后进行同胞交配,可获得F2代鼠。对获得的F2代鼠进行PCR及测序鉴定,理论上,F2代鼠中25%为敲入位点一致的纯合子鼠,有50%为只有一条染色体敲入的杂合子鼠,有25%为野生型鼠。