ES打靶基因敲除/敲入小鼠

ES打靶基因敲除/敲入小鼠

制作原理

      传统的基因打靶技术制备基因敲除(Knock out)/敲入(Knock in)小鼠是建立在DNA同源重组与胚胎干细胞等技术基础上的分子生物学技术。

      同源重组是指当外源DNA片段与宿主基因组片段同源性高时,同源DNA区部分可与宿主DNA的相应片段发生交换(即同源重组)。

      基因打靶就是通过同源重组技术将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点,以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的。基因打靶技术目前已被广泛认为是一种理想的特定修饰与改造生物体遗传物质的最佳方法。尤其是条件性和诱导性基因打靶系统的建立,使得对基因在时间和空间上的靶位修饰更加明确、效果更加精确可靠,该技术的发展已经为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究和治疗手段,并已显示出巨大的应用前景及商业价值。

 

服务流程

 

 

服务周期

 

 

小鼠品系

ES细胞品系:C57BL/6N(black)、C57BL/6N(agouti)、129(agouti)

 

基因打靶常用小鼠模型

完全性基因敲除小鼠

  完全性基因敲除是通过基因敲除技术,把需要敲除目的基因的所有外显子或几个重要的外显子或者功能区域敲除掉,获得全身所有的组织和细胞中都不表达该基因的小鼠模型。
应用
用于研究某个基因(要求该基因非胚胎致死性基因)对全身生理病理的功能。

建系原则与流程

1、嵌合体小鼠鉴定:通过毛色判断嵌合体(黑白相间) ,黑色占的比例越大,嵌合率越高。

2、去除抗性基因 Neo:选择嵌合率高的嵌合体小鼠和Flp deleter小鼠杂交,PCR鉴定,获得去掉打靶载体中的 Neo 基因的F1 代(杂合子);

3、再挑选一对F1 代小鼠进行自交,通过 PCR 鉴定筛选得到去除Neo的纯合子的 F2 代 KO 小鼠(gene-/-)。

**PCR 鉴定引物设计原则:根据Neo基因前后设计鉴定引物,鉴定Neo基因是否去除。

条件性基因敲除小鼠

    条件性基因敲除是通过把两个LoxP位点插入到目的基因的一个或几个重要外显子的两端以制备出floxed小鼠, 该floxed小鼠在与表达Cre重组酶小鼠杂交之前,该目的基因表达完全正常,而当该floxed小鼠与组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后,可以 在特定的组织或细胞中敲除该基因,而该基因在其它组织或细胞表达正常。

应用

1、用于具有胚胎致死性目的基因的研究;

2、用于研究基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能;

3、与控制Cre或Flp表达的其它诱导系统相结合,还可以对某一基因的表达同时实现在时间和空间两方面的调控。



建系原则与流程

1、嵌合体小鼠鉴定:通过毛色判断嵌合体(黑白相间) ,黑色占的比例越大,嵌合率越高。

2、去除抗性基因 Neo:嵌合体小鼠和全身表达Flp deleter小鼠杂交,PCR鉴定,获得去掉打靶载体中的 Neo 基因的F1 代(杂合子);

3、挑选一对F1 代小鼠进行自交,通过 PCR 鉴定筛选得到去除Frt两个位点片段纯合子的 F2代小鼠(命名:geneflox/ flox)。

备注:geneflox/ flox 两条染色体上都带有 loxp–gene-loxp 的模型。

**PCR 鉴定引物设计原则:根据Frt 前后及3’arm序列设计鉴定引物鉴定Neo是否去除;根据LoxP前后设计引物鉴定LoxP。

4、组织特异性敲除模型: Geneflox/ flox 小鼠与组织特异性Cre小鼠杂交, PCR 鉴定,得到敲除 gene 的杂合子F3 代小鼠;

5、挑选一对F3 代小鼠进行自交, 通过 PCR 鉴定筛选得到去除 gene 纯合子的 F4 代 cKO 小鼠。

**PCR鉴定引物设计原则:根据cKO region前5’arm及3’arm基因序列设计鉴定引物鉴定是否敲除。

基因敲入小鼠

   基因敲入可以在目的基因位置引入特定的突变或外源基因。比如在目的基因上引入点突变(模拟人类遗传疾病模型) ;或将报告基因(如EGFP,mRFP,mCherry,mYFP,或LacZ等)通过同源重组的方式引入目的基因的特定位点,从而可以通过报告基因来跟 踪目标基因的表达。也可以用报告基因取代小鼠本身的基因,使KO/KI同时发生。

应用

1、用于药物筛选相关研究;

2、用于信号通路的研究;

3、用于示踪的相关研究。

建系原则与流程

1、嵌合体小鼠鉴定:通过毛色判断嵌合体(黑白相间) ,黑色占的比例越大,嵌合率越高。

2、去除抗性基因 Neo:嵌合体小鼠和Flp deleter小鼠杂交,PCR鉴定,获得去掉打靶载体中的 Neo 基因的F1 代(杂合子);

3、挑选一对F1 代小鼠进行自交,通过 PCR 鉴定筛选得到去除Neo的纯合子的 F2 代 KI 小鼠。

**PCR 鉴定引物设计原则:根据Neo基因前后设计鉴定引物,鉴定Neo基因是否去除。

 

 

人源化小鼠

   人源化小鼠模型是指带有功能性的人类基因、细胞或组织的小鼠模型。这种模型通常被用于人类疾病体内研究(in vivo study)的活体替代模型。由于人类生理与动物生理有显著的差别,利用动物模型得到的实验结果有时不能适用到人体上。比如, 有些利用小鼠等动物模型开发 的药物在人体上并没有效果。所以,利用转基因或同源重组的方法,将人类基因“放置”在小鼠模型上所制备的人源化小鼠模型,大大提高了这类小鼠模型作为模拟 某些人类疾病的有效性。

应用
1、在艾滋病、癌症、传染病、人类退化性疾病、血液病研究领域等都有广泛的应用;
2、药物临床前模拟实验。

 

KO-First技术制作基因敲除鼠

   KO-First技术是通过在内含子中插入一个两边带有FRT位点的基因破坏盒来达到敲除的目的,这个破坏盒含有Splice acceptor,报告基因和Neo。除此之外,在目的基因敲除的外显子两侧各插入两个LoxP位点。因此得到的小鼠是目的基因敲除同时敲入报告基因与抗 性基因的小鼠。通过灵活选择Cre/LoxP重组系统或者Flp/FRT重组系统,可达到同时获得完全性敲除和条件性敲除的实验目的。即当该小鼠与表达 Cre的小鼠交配时,可获得目的基因敲除同时敲进报告基因的小鼠;当该小鼠与Flp小鼠交配时,可还原已敲除基因的表达,获得基因条件性敲除小鼠,在此基 础上Cre小鼠交配又可获得目的基因敲除小鼠。