慢病毒包装

慢病毒包装

赛业生物采用第3代重组慢病毒包装系统制备病毒颗粒。为了增加慢病毒的安全性能,病毒制备所必需的元件序列被拆分到4个质粒当中,分别是:
1)1个编码目的基因的慢病毒转移质粒。目的基因两侧各有一个LTR(long terminal repeat)序列,LTR序列促使目的基因整合到目的细胞基因组里。为了提高安全性能,转移质粒的3’ LTR缺失了部分序列,使得整合后的病毒基因组失去自我复制能力。
2)2个包装质粒。其中一个质粒编码Rev, 另外一个质粒编码Gag和Pol。
3)1个编码包膜蛋白的质粒。

 

利用上述质粒包装出来的重组慢病毒颗粒,被称为自我失活VSV-G假型慢病毒(self-inactivating VSV-G pseudotyped lentivirus)。

 

每次包装重组慢病毒,包装质粒和编码包膜蛋白的质粒都是固定不变的,变的是编码目的基因的转移质粒。因此,您需要设计的是转移质粒。登陆www.vectorbuilder.com即可轻松快捷设计转移质粒!

 

慢病毒生产

生产携带目的基因的重组慢病毒颗粒,过程如下图:

首先将转移质粒、包装质粒和包膜蛋白质粒转染到293T细胞。更换新鲜的培养基后,继续培养48~72小时。收集培养液,进行离心浓缩后,就可得到转导细胞级别的病毒颗粒。如果您想获得注射动物级别的超纯病毒颗粒,可以利用蔗糖超速离心进一步去除杂质,从而获得纯度更高的病毒颗粒。

 

质量控制

我们会对每一批病毒都进行滴度检测,严格控制质量,让你百分百放心。针对用携带荧光报告基因的转移质粒生产的病毒,我们会先用荧光法检测病毒的转导率,如能达到使用要求,再进一步采用qPCR法检测病毒滴度。

 

服务明细

 

赛业生物不仅仅提供基因表达慢病毒定制服务,还提供shRNA干扰慢病毒和gRNA慢病毒定制服务。您可根据实验需要,选择一款适合于您的重组慢病毒来开展基因功能研究工作。订制病毒从订制转移质粒开始,登陆www.vectorbuilder.com即可轻松快捷地设计转移质粒!

 

慢病毒载体

(一)基因表达慢病毒载体

 

基因表达慢病毒载体由慢病毒基因组序列和细菌质粒序列构成。细菌质粒序列含有一个Ampicillin抗性基因和一个高拷贝复制子pUCori。慢病毒基因组序列是从元件5’LTR开始,到3’LTR结束。


慢病毒基因组序列可容纳两个外源基因表达盒子:一个是目的基因表达盒子,另外一个是marker基因表达盒子。Marker基因表达盒子已经克隆在载体上,无需重新构建。我们提供了荧光marker、抗药性marker或者荧光/抗药性双marker供您选择。目的基因表达盒子则包括两部分序列:启动子和目的基因。每次构建载体,只需通过site-specific recombination cloning技术将感兴趣的启动子和目的基因克隆到载体上即可。

 

1、克隆方法

我们采用位点特异性重组的克隆方法,将感兴趣的启动子和目的基因克隆到慢病毒骨架上。如下图:

一般来说,我们将启动子放在pUp入门克隆上,将目的基因放在pDown入门克隆上。由于我们已建成了一套常用启动子的pUp,因此每次构建时,我们只需构建一个携带目的基因的pDown,再与您选择的启动子和慢病毒骨架载体进行位点特异重组反应则可获得基因表达慢病毒载体。

 

2、质量控制

我们会对每一个pDown进行目的基因片段测序,序列正确后再进行重组,然后对基因表达慢病毒载体挑克隆,并进行酶切鉴定。酶切鉴定合格后交付。

 

(二)shRNA干扰慢病毒载体

 

shRNA干扰慢病毒载体由慢病毒基因组序列和细菌质粒序列构成。细菌质粒序列含有一个Ampicillin抗性基因和一个高拷贝复制子pUCori。慢病毒基因组序列是从元件5’LTR开始,到3’LTR结束。


慢病毒基因组序列可容纳两个外源基因表达盒子:一个是shRNA表达盒子,另外一个是marker基因表达盒子。Marker基因表达盒子已经克隆在载体上,无需重新构建。我们提供了荧光marker、抗药性marker或者荧光/抗药性双marker供您选择。shRNA表达盒子则包括三部分序列:U6启动子、shRNA和终止子。U6启动子已经克隆在载体上,每次构建载体,只需通过annealing-ligation技术将感兴趣的shRNA和终止子克隆到载体上即可。

 

1、 克隆方法

我们采用引物退火连接的克隆方法,将shRNA克隆到慢病毒骨架上。如下图:

我们的shRNA干扰慢病毒载体使用了human U6 promoter转录shRNA。shRNA在体内被剪切成21 nt的单链RNA,并与mRNA互补引起mRNA的降解。而干扰效率则取决于21 nt的单链RNA是否只与目标mRNA特异性100%匹配。您可以登陆www.vectorbuilder.com选择感兴趣的人、小鼠和大鼠的shRNA进行载体设计。

 

2、 质量控制

我们会对每一个shRNA干扰慢病毒载体进行挑克隆,并测序shRNA片段。正确后,再进行酶切鉴定,酶切鉴定合格后交付。

 

(三)gRNA慢病毒载体

 

gRNA慢病毒载体由慢病毒基因组序列和细菌质粒序列构成。细菌质粒序列含有一个Ampicillin抗性基因和一个高拷贝复制子pUCori。慢病毒基因组序列是从元件5’LTR开始,到3’LTR结束。


慢病毒基因组序列可容纳两个外源基因表达盒子:一个是目的基因表达盒子,另外一个是marker基因表达盒子。Marker基因表达盒子已经克隆在载体上,无需重新构建。我们提供了荧光marker、抗药性marker或者荧光/抗药性双marker供您选择。gRNA表达盒子则包括三部分序列:U6启动子、gRNA和终止子。U6启动子已经克隆在载体上,每次构建载体,只需通过annealing-ligation技术将感兴趣的gRNA打靶序列克隆到载体上即可。gRNA打靶序列与gRNA scaffold序列构成一个完整的gRNA。

 

1. 克隆方法

我们采用引物退火连接的克隆方法,将gRNA克隆到慢病毒骨架上。

我们的CRISPR/Cas9慢病毒载体使用了human U6 promoter转录gRNA。gRNA被Cas9识别,与基因组序列结合,从而引起Cas9对基因组序列的剪切。剪切效率取决于gRNA 是否只与目标基因组序列特异性100%匹配。目标序列的选择还需要考虑下游有PAM特征的序列。您可以登陆vectorbuilder.com选择感兴趣的人、小鼠和大鼠的gRNA进行载体设计。

 

Tips

CRISPR慢病毒系统

CRISPR慢病毒系统包括两个载体:

1)gRNA慢病毒载体

2)Cas9慢病毒载体

Cas9慢病毒载体利用CBh启动子共表达humanized Cas9基因和Hygromycin抗药性基因。gRNA慢病毒载体利用U6 promoter表达gRNA,同时携带了一个表达抗药性基因的基因表达盒子。在设计gRNA慢病毒载体时,请选择非Hygromycin抗药性基因(Puromycin、Neomycin和Blasticidin),两个载体需要不同的抗药性基因配套使用才能起到药筛的效果。

 

2、 质量控制

我们会对每一个CRISPR/Cas9慢病毒载体挑克隆,并测序gRNA片段。测序正确后,再进行酶切鉴定,酶切鉴定合格后交付。

 

病毒包装服务