TALEN基因敲除/敲入鼠

TALEN基因敲除/敲入鼠

制作原理

TALEN(Transcription Activator-Like Effector Nuclease) 技术是基于对DNA识别的TALEN臂和人工改造的核酸内切酶的切割域(FokⅠ)的结合对细胞基因组进行修饰而实现的。TALEN的DNA识别域是由一些非常保守的重复氨基酸序列模块组成,每个模块由34个氨基酸组成,其中第12和13位的氨基酸种类为可变的(RVDs),且决定了该模块识别靶向位点的特异性。通过DNA识别域结合到靶位点上,以及FokI的切割域形成二聚体后,可特异性对目标基因DNA实现切断。在非同源末端连接修复过程中,DNA双链断开后会由于碱基的随机增减造成目标基因功能缺失。 该技术目前已成功应用于植物、细胞、酵母、斑马鱼及大、小鼠等各类模式动物的研究领域。

 

服务流程和周期

 

 

TALEN技术流程图

TALEN由四部分组成:N端序列,RVD,C端序列,FokI。利用Type II 限制性内切酶可以将RVDs模块分别生成不同的粘性末端,同时又不留有酶切位点, 通过一系列的相应酶切连接反应实现RVDs与TALEN骨架的无缝连接。


TALEN系统利用FokI的内切酶活性打断目标基因。FokI形成二聚体发挥活性,在TALEN结合臂的引导下,发挥特异性内切酶活性,在两个靶位点之间剪切DNA,形成DSB(Double- Strand Breaks),诱发DNA损伤修复机制。细胞通过NHEJ(Non- homologous End Joining)修复DNA,在此修饰过程中导致删除或插入了一定数目(非3的倍数)的碱基,造成移码,形成对目标基因特异性KO的突变体。

 

TALEN技术特点

1、可以应用于大小鼠,无动物品系限制;

2、修饰效率可达90%以上;

3、实验周期短、价格低。

 

TALEN基因敲除常用大小鼠模型

完全性基因敲除鼠

TALEN完全性基因敲除是通过TALEN基因敲除技术,针对靶基因设计和构建TALEN质粒,造成目的基因的功能区域移码突变,获得全身所有的组织和细胞中都不表达该基因的大小鼠模型。

 
建系原则与流程

1、TALEN技术获得的基因敲除鼠,由于是在大鼠或者小鼠的原核受精卵期进行的修饰,获得的F0鼠一般是杂合子,并且每只FO鼠由于移码突变情况可能不一样,所以每只F0鼠需要作为一个独立的谱系进行传代;

2、原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代杂合子鼠,F0代杂合子鼠与野生型鼠进行交配,获得测序鉴定阳性的F1代杂合子鼠(可能有多种突变类型的F1);

3、选择来自同一只F0代鼠,突变类型一致的F1代鼠,达到性成熟后与进行同胞交配,可获得F2代鼠。对交配获得的F2代鼠进行PCR及测序鉴定,理论上,F2代鼠中25%为相同突变型的纯合子鼠,有50%为只有一条染色体突变的杂合子鼠,有25%为野生型鼠。

基因敲入鼠

TALEN 基因敲入鼠是利用TALEN基因敲入技术,针对靶基因设计、构建TALEN质粒和donor vector,通过FOKI二聚体的切割作用和同源臂的同源重组,引入特定的突变或外源基因。比如在目的基因上引入点突变(模拟人类遗传疾病模型) ;或将报告基因(如EGFP,mRFP,mCherry,mYFP,或LacZ等)通过同源重组的方式引入目的基因的特定位点,从而可以通过报告基因来跟 踪目标基因的表达;也可以用报告基因取代大小鼠本身的基因,使KO/KI同时发生。

TALEN基因敲入鼠包括点突变、小片段基因敲入。

 

点突变鼠的建系原则与流程

1、通过针对靶基因设计、构建TALEN质粒和含有突变位点信息的donor vector,将以上质粒转录为mRNA后,原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代杂合子鼠;

2、F0代杂合子鼠与野生型鼠进行交配,获得PCR和测序鉴定阳性的F1代杂合子鼠;

3、选择来自同一只F0代鼠,敲入位点一致的F1代鼠,达到性成熟后进行同胞交配,可获得F2代鼠。对获得的F2代鼠进行PCR及测序鉴定,理论上,F2代鼠中25%为敲入位点一致的纯合子鼠,有50%为只有一条染色体敲入的杂合子鼠,有25%为野生型鼠。

备注:TALEN小片段基因敲入鼠的建系原则、流程与点突变鼠一致。