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通过借助人体自身的免疫系统发挥对肿瘤细胞的杀伤作用,免疫细胞疗法有望成为“治愈”癌症的突破性策略。其中,嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy, CAR-T)已经在多种血液肿瘤的治疗上取得了瞩目的效果,截止到今年,全球已经有7款CAR-T细胞治疗产品上市,其中包括在中国上市的3款。

CAR-T细胞疗法千里之行,始于基础研究每一个稳扎猛打的环节。其研究流程一般包括CAR分子的设计、慢病毒包装、CAR-T细胞构建、体外体内杀伤验证等。但与小分子或抗体药物不同的是,CAR-T是一种“活的”细胞类药物,想要构建出有效且稳定的CAR-T细胞,需要充分考虑诸多因素,如CAR分子结构的合理设计、T细胞转染条件的摸索、CAR-T细胞的鉴定等。

基于在肿瘤免疫领域多年的研究经验,赛业生物搭建了CAR-T细胞治疗体内体外一站式服务平台,可为科研工作者提供从scFv序列筛选、CAR分子设计到体外体内杀伤实验的全流程服务,帮助客户提升CAR-T/NK相关研究的效率和精准度。欢迎拨打400-680-8038或邮件至info@cyagen.com或点击侧边栏在线咨询联系我们。

CAR-T细胞治疗体内体外
一站式服务平台
病毒载体制备平台
  • CAR分子设计
  • 慢病毒包装和优化
  • CAR-T细胞构建
点我咨询
肿瘤模型构建平台
  • 靶细胞构建
  • C-NKG重度免疫缺陷小鼠模型
  • CDX小鼠肿瘤模型
  • PBMC/HSC免疫系统人源化模型
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体外药效评价平台
  • CAR-T细胞体外杀伤功能评价
  • 细胞因子检测
  • 细胞增殖/凋亡/迁移/侵袭等功能学实验
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体内药效评价平台
  • CDX C-NKG小鼠和CDX PBMC/HSC C-NKG小鼠模型构建
  • CAR-T/TCR-T/NK/TIL细胞药效评价
  • 免疫组化(IHC)、HE染色、淋巴细胞浸润分析
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项目类型 项目技术难点 赛业生物平台服务优势
靶细胞构建 靶细胞种类难以选择 丰富的靶细胞库,拥有多种靶点过表达的肿瘤细胞/CHO/HEK293细胞现货
靶点的表达水平不够高 500+稳转株构建项目经验
CAR慢病毒包装 缺乏CAR分子结构设计经验 具有丰富的多种靶点CAR分子设计经验
病毒滴度低及纯化难 高质量慢病毒包装,多篇文献引用发表
CAR-T/NK细胞构建 T/NK细胞的培养难 16年的原代细胞培养经验
T/NK细胞的转染条件摸索耗时;转染后细胞鉴定难 充分总结人/鼠源免疫细胞转染参数的优化方案
体外杀伤实验 评价指标难以选择 成熟的体外药效实验平台
数据分析 专业的数据分析人员
案例展示 案例展示
1
CAR分子设计及慢病毒包装
2
CAR-T细胞制备
3
体外药效评价

对于CAR-T细胞治疗,CAR分子是影响治疗有效性的关键。CAR分子结构包含识别肿瘤抗原的抗体单链可变区、铰链区,以及胞内的共刺激结构域、信号传导域,其设计的合理性会影响CAR-T细胞的杀伤效应、体内持久性、以及安全性等。因此,针对不同的肿瘤治疗靶点,我们需要设计合理有效的CAR分子,并包装成CAR慢病毒,用于后续CAR-T细胞的构建。

CD19抗原慢病毒包装及滴度检测

将表达CD19抗原的慢病毒纯化液进行梯度稀释(0.01、0.1、1、10 μl),分别加入到相同数量的293T细胞中,72小时后流式检测293T细胞阳性率,进而按如下公式计算慢病毒的转导滴度:

图1. CD19抗原慢病毒滴度检测结果

如图所示,CD19抗原阳性细胞的数量随转染病毒梯度的增加而逐渐升高,表明该慢病毒有良好的感染活性,并按上述公式计算病毒滴度为:1.4×108 Tu/ml。

CD19-293T稳转细胞株构建

我们将成功制备的上述CD19病毒转染293T细胞,经过多轮筛选获得阳性率几乎为100%的CD19-293T细胞,其阳性率检测结果如下图所示。

图2. CD19-293T稳转细胞株阳性率检测结果
CD19-CAR慢病毒包装及滴度检测

我们将针对CD19靶点设计的二代经典CAR分子构建到慢病毒载体中,并包装得到CD19-CAR慢病毒,采用上述方法检测病毒滴度,经计算后得到病毒滴度为:4.33×108 Tu/ml。

图3. CD19 CAR分子结构,其中VH和VL序列来源于CD19抗体FMC63克隆
图4. CD19 CAR慢病毒滴度检测结果
其他慢病毒感染
图5. 其他细胞慢病毒感染效果图

在完成CAR病毒的包装后,下一步需对T细胞进行细胞转染,从而获得CAR-T细胞。我们建立了两种不同的高效的T细胞制备方法,均能制备高纯度的T细胞(CD3+细胞占比可达98%以上),但二者扩增出来的不同亚型T细胞的占比有较大的差异,Method 1扩增出来的T细胞以CD8+T细胞亚型为主,而Method 2可扩增出CD8+T细胞和CD4+T细胞占比差异较小的T细胞群体,这两种方法为研究不同亚型T细胞的作用奠定了坚实的基础。

图6. T细胞表型分析实验结果

慢病毒是目前构建CAR-T细胞的重要基因递送工具,不同的T细胞活化扩增方法、不同的转染时间等多方面因素都会影响CAR-T细胞的阳性率。我们通过多方面的实验条件优化,成功建立了高效的基于慢病毒转染的CAR-T细胞制备工艺。下图展示的是CD19 CAR-T细胞阳性率检测结果,该结构中使用了来源于CD19抗体FCM63克隆的scFv,因此可通过抗FMC63 scFv抗体对其转染效率进行检测,结果表明CD19 CAR-T细胞的阳性率可达45.59%,表明成功构建了阳性率较高的CD19 CAR-T细胞。

图7. CD19 CAR-T细胞阳性率检测结果

构建好CAR-T细胞即可进行相关的药效评价,通常采用不同的效靶比,观察CAR-T细胞对靶细胞的杀伤作用。我们将CD19 CAR-T细胞和T细胞分别以不同效靶比同Nalm6细胞共孵育48h,采用流式法检测肿瘤细胞凋亡。如图所示,与T细胞组相比,不同效靶比条件下,CD19 CAR-T细胞均展现出了对Nalm6细胞明显增强的特异性细胞毒性作用。

图8. FMC63 CAR-T细胞杀伤Nalm6肿瘤细胞实验结果
A. Nalm6细胞表面CD19抗原阳性率检测结果;B. CD19 CAR-T细胞杀伤Nlam6细胞实验结果;
C. CD19 CAR-T细胞杀伤Nlam6细胞培养上清中IFN-γ含量检测结果