Nature Biotech：活性更高且脱靶更少的Cas12a变体

麻省总医院的研究人员近日对Cas12a核酸酶进行了改造，使得它们可以靶向更广泛的PAM，具有更强的编辑活性，并且具有较低的脱靶效应。这项成果于本周发表在《Nature Biotechnology》杂志上。

经过改造的氨基酸球菌属Cas12a变体（enAsCas12a）能够靶向许多以前难以接近的PAM。此外，与野生型AsCas12a相比，enAsCas12a变体在经典TTTV PAM位点上的基因组编辑活性要高两倍。

“enAsCas12a提高了多重基因编辑、内源基因激活和C-T碱基编辑的效率，同时我们设计了一个高保真版本的enAsCas12a（enAsCas12a-HF1）以减少脱靶效应，”作者在文中写道。他们认为enAsCas12a在基因编辑和表观遗传编辑上有着更广泛的应用。

一般来说，Cas12a核酸酶通过识别富含T的PAM序列来切割靶位点。它仅需要一段40 nt的crRNA来控制靶向特异性，并且具有RNase活性，可通过poly-crRNA转录本加工来实现多重靶向。尽管Cas12a酶已经表现出多方面的潜力，但它的限制在于需要更长的5'-TTTV PAM。

在这项研究中，Keith Joung领导的团队通过结构指导的蛋白质工程来扩展Cas12a的PAM识别范围，并设计出10种单个氨基酸替换的变体。与野生型的AsCas12a相比，10种变体中的4种在经典和非经典PAM上表现出更高的基因编辑活性。后续分析表明，两种变体在非经典PAM位点上表现出最高的编辑活性。

研究人员发现，enAsCas12a变体将靶向范围扩大了七倍左右。他们还利用poly-crRNA芯片来靶向人类细胞中的三种内源基因，并比较AsCas12a、enAsCas12a和LbCas12a的编辑活性。结果表明，enAsCas12a与AsCas12a和LbCas12a相当或更高。

当研究人员观察脱靶效应时，他们发现enAsCas12a比野生型AsCas12a有更多的脱靶。为了改善enAsCas12a的特异性，他们随后通过氨基酸替换来设计一种高保真的变体。研究人员发现，

enAsCas12a-N282A在单个错配不耐受方面表现出最大的改善，同时保留了与enAsCas12a相似的靶向活性。

为了更彻底地评估N282A替换是否影响靶向活性，研究人员通过体外切割分析来比较enAsCas12a和enAsCas12a-HF1，发现这两种酶有着相似的切割图谱。同时，他们还比较了两种酶的靶向活性，发现在多个经典和非经典PAM位点上有着相似的活性。

研究人员表示：“我们的结果提供了一个重要的概念验证，即CRISPR酶的靶向效果可通过基因工程来增强，这种策略可以扩展到其他CRISPR核酸酶。未来，我们需要更多的工作来确定enAsCas12a和enAsCas12a-HF1是否能够应用于治疗。”

原文检索

Engineered CRISPR–Cas12a variants with increased activities and improved targeting ranges for gene, epigenetic and base editing

Nature Biotechnology (2019)

转载标题：Nature Biotech：活性更高且脱靶更少的Cas12a变体 

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