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CRISPR可能导致大量重复片段插入基因组 且无法被PCR等标准方法识别

日期: 2020年02月26日


    

在基因编辑技术被越来越多人所了解的当下,这一领域的突破性研究与进展往往让科学家们如获至宝。

 

近日,一个研究团队在国际知名期刊《科学进展》(Science Advances)上发表了论文,论文中研究的结果显示:使用CRISPR对小鼠进行基因敲入时,DNA序列中会出现大量重复片段,且无法被PCR等常规方法检测出。

 

Science Advances

 

CRISPR-Cas9介导的同源性指导的DNA修复是在包括小鼠和人类在内的多种模式生物中进行精确基因编辑的一种选择方法,已被世界各地用于实验动物和细胞研究,还已经在临床试验中用于治疗患者。生物医学界的广泛使用改进了该方法,使其更加高效且具有序列特异性。但是,迅速发展的技术仍然存在“陷阱”,研究人员一直在努力通过改善该方法,希望将不良影响最小化。

 

在生成六个不同的条件基因敲除小鼠模型的过程中,研究人员们发现频繁(有时仅是同源性)指导的修复和/或非同源末端连接机制导致供体DNA模板多次从头到尾插入。令人不安的是,在大多数情况下,常规应用的PCR分析未能识别出这些多重整合事件,从而导致大量误称精确编辑的等位基因。

 

于是他们怀疑,这种复制在亲本小鼠及其后代中可能很普遍,而通常用于分析此类构建体的标准PCR形式却忽略了它们。他们还告诫,对修饰的等位基因进行全面分析是必不可少的,并提供切实可行的解决方案,以正确识别精确编辑的染色体。

最后,撰写论文的德国研究团队出于课题需要,决定将编码钙结合蛋白的S100A8基因通过CRISPR技术插入小鼠体内,以替换原始基因。

 

S100A8靶向基因机制的PCR分析

上图为S100A8靶向基因机制的PCR分析

 

在对这些基因编辑小鼠的50多只自然繁殖后代的测序中,研究人员发现,使用经过特别设计、能扩增重复序列的特殊PCR ,能够检测出其中30多只小鼠携带大量插入片段的重复序列;而普通的标准PCR只能在50多只小鼠中检测到2只存在这样的重复序列。

 

S100A8基因靶向策略

上图为S100A8基因靶向策略的示意图

 

S100A8的侧翼是指导特定酶切除该基因的特定序列。一旦这些小鼠与仅在靶标组织中表达酶的其他转基因动物杂交,将导致基因在特定组织中的敲除。

 

研究者认为,“常规PCR方法无法识别这一现象”,如果不使用专门针对重复序列检测的PCR,研究人员可能无法意识到模型动物的基因组中会隐藏不必要的突变。而对于产生条件基因敲除小鼠模型的研究人员而言,重复实验可能导致蛋白质在所有组织中被有效敲除或产生其他不良影响,这往往会损害人们对基因的功能研究。

 

研究人员们于是建议道,研究人员在使用CRISPR进行敲入时,利用特殊形式的PCR分析,Southern印迹法或能够分析重复序列的全基因组测序新方法进行分析,了解是否正确编辑了基因组。

 

“我们需要明确的是,CRISPR-Cas9是一种用于基因删除和理解生物学的强大方法,”诺丁汉大学的分子生物学家Ed Bolt表示,“但是想要搞清楚用CRISPR-Cas9插入DNA或敲入基因的原理,我们还差得很远。”

 

参考来源:https://advances.sciencemag.org/content/6/7/eaax2941

 

转载标题:研究发现:CRISPR可能导致大量重复片段插入基因组 且无法被PCR等标准方法识别

 

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