CAR分子设计与慢病毒包装的应用知多少?
历经多年发展,嵌合抗原受体CAR-T细胞疗法已成为癌症治疗的革命性方法,其中,CD19靶点药物在治疗B细胞恶性肿瘤方面更是取得了前所未有的成功,并于2017年获得美国FDA批准。其中,CAR分子设计及病毒包装是影响CAR-T细胞治疗有效性的重要环节,在前几期文章里,我们集中梳理了以下几个要点:
- 介绍CAR结构及其设计原则
- 盘点CAR-T细胞治疗的局限性及潜在风险
- 如何打破困局、提升治疗效果的创新策略
今天结合具体的研究案例数据,为大家展示在实际的应用情境中,我们可以如何更好地了解进而优化CAR分子设计、载体构建及病毒包装等一系列工艺流程。
CAR分子设计
CAR分子全称为嵌合抗原受体,其结构包括信号肽分子,抗体来源的单链可变区、铰链区、跨膜区,共刺激分子结构域、CD3ζ信号转导域。
- scFv筛选:scFv亲和力和特异性对CAR分子功能有重要影响,筛选合适的scFv十分重要
- 连接基团(Linker)的优化:设计不同长度的Linker,使VH和VL之间的灵活度增加,进而影响结合亲和力
- 铰链区(Hinge)的优化:设计不同长度的Hinge,增加抗原结合域的空间灵活度
- 共刺激结构域的选择:可选择不同的共刺激分子(如4-1BB或CD28等)
- 报告基因:可连接绿色荧光蛋白基因,表征CAR分子是否转导成功
CAR分子结构示意图
分类 |
来源 |
功能 |
表达部位 |
信号肽分子 |
CD8α、GM-CSF等 |
引导CAR分子上膜 |
胞外 |
抗体scFv |
专利、文献、抗体开发 |
靶向识别肿瘤抗原 |
胞外 |
铰链区 |
CD8α、IgG1、IgG4、IgGD等 |
维持scFv同细胞膜间的相对空间构象 |
胞外 |
跨膜区 |
CD8α、CD28、CD4等 |
锚定CAR分子膜表达 |
跨膜 |
共刺激分子 |
4-1BB、CD28、CD27、ICOS等 |
提供T细胞活化第二信号 |
胞内 |
信号转导分子 |
CD3ζ |
提供T细胞活化第一信号 |
胞内 |
表1 CAR分子设计中常用原件
载体构建
在设计好CAR分子后,通常需要对其进行基因合成并亚克隆至慢病毒穿梭质粒上,构建后的其结构通常如图所示。赛业生物可以提供多种现货型的CAR慢病毒质粒载体库,靶点包括人的CD19、BCMA、GPC3、FAP和HER2等,且该载体库还在不断的丰富和更新中。
CAR慢病毒载体结构图示
病毒包装和纯化
赛业生物在慢病毒制备方面具有多年的经验,可以提供多样化的慢病毒制备服务。我们使用了安全性高的第三代慢病毒包装系统,其制备流程如图所示。
慢病毒包装技术路线
解决策略推荐
基于多年在肿瘤免疫领域的研究经验,赛业生物可为CAR-T/其它细胞治疗研究者提供专业的CAR分子设计及载体构建、CAR慢病毒制备、靶抗原稳转细胞株构建等服务。
- 丰富的CAR分子设计经验,可提供专业的各种定制化的CAR分子设计服务
- 丰富的CAR慢病毒质粒载体库,可提供快速优质的服务
- 抗原高表达、高稳定性的稳转细胞株构建服务
- 高滴度高纯度的慢病毒制备
- 严格的质控标准
不仅如此,我们能给予你关于CAR-T/其他细胞治疗研发的全方位支持,从抗体开发、CAR病毒制备、免疫细胞制备和表型检测,到细胞模型与动物模型的构建、体外/体内药效评价一应俱全。
服务案例
- CD19抗原慢病毒滴度检测
将表达CD19抗原的慢病毒纯化液进行梯度稀释(0.01、0.1、1、10μL四个梯度),分别加入到相同数量的293T细胞中,72小时后流式检测293T细胞阳性率(即被慢病毒感染的293T细胞占细胞总数的百分比),进而计算慢病毒的转导滴度。如图所示,CD19抗原阳性细胞的数量随转染病毒梯度的增加而逐渐升高,表明该慢病毒有良好的感染活性,并计算病毒滴度为:1.4×108 TU/mL。
CD19抗原慢病毒滴度检测结果
- CD19-293T稳转细胞株构建
使用上述CD19抗原慢病毒转染293T细胞,经过多轮筛选,得到CD19抗原高度均一表达的CD19-293T稳转细胞。
CD19-293T细胞CD19抗原阳性率检测结果
- FMC63 CAR慢病毒滴度检测
我们设计了如下结构的靶向CD19抗原的FMC63 CAR分子,并将其构建慢病毒载体上,进行慢病毒制备。采用上述方法检测FMC63 CAR慢病毒滴度,病毒滴度约为:4.33×108 TU/mL。
FMC63 CAR分子结构
FMC63 CAR慢病毒滴度检测结果
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