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“别人家的导师”卷上太空,我却看着自己KO细胞的实验进展沉默了

今天是第七个全国科技工作者日(5月30日),神舟十六号也于上午发射升空,开启探索太空新征程。听说此前神十六发布会间隙,作为乘组成员之一的桂海潮还不忘cue自己的学生交论文,对此,有网友戏称“天地连线开组会安排上了!”

如果导师出差还要坚持开组会,屏幕前的你会不会也为这样的师生情所感动(这里要不要加个狗头emoji)然后开始疯狂赶实验进度,手里的细胞挑得飞起,以免导师出其不意问上一句“基因该敲的都敲完了吧?”

 

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说起基因敲除,很多小伙伴大概总是为课题的这个问题那个问题发愁。眼看年中将近,我们贴心为大家准备了一系列专场活动,本期放出的618分会场第一波福利中,除互动礼品外,还有热门活动「全基因组敲除细胞构建计划」,交付单克隆纯合子,低至6980元,扫码即可快速查询!

全基因组敲除细胞构建计划 

 

KO细胞的常见问题解答 

  • 往期回顾

Q1: 基因敲除的sgRNA如何设计?

Q2: 如何避免脱靶效应?

 

  • 本期内容

Q3:CRISPR-Cas系统的活性检测方法有哪些?

通常我们都是采用各个设计网站预测,得到我们的gRNA,那如何能够快速、准确的验证CRISPR-Cas系统是否能发挥作用呢?

  • 荧光活性检测法。在Cas和gRNA的作用下,靶点位置的双链DNA会被切割形成DSB,细胞通过同源重组形成有活性的荧光蛋白,可通过流式细胞仪来检测荧光强度是否增强,以此来判断Cas及gRNA的活性及敲除效率。
  • 错配酶法。对修饰后的靶序列进行PCR扩增过程中,会形成含有错配的DNA双链,将经过错配酶切割后的产物进行凝胶电泳,检测CRISPR-Cas系统的切割活性。
  • 套峰检测法。对修饰后的靶序列进行PCR并测序,通过分析Spacer区域套峰情况来分析CRISPR-Cas系统的活性。

 

Q4:实现基因功能缺失,我要做敲低(RNAi)还是敲除?

  • 当敲除可能会导致细胞增殖非常缓慢或停止生长,或在细胞转染后的cell pool阶段检测效率呈显著下降趋势,即可判定可能出现敲除致死的情况,建议用RNAi。
  • 由于存在部分强功能蛋白,即使表达下调了,仍然有较强的功能,如果RNAi始终做不出表型,但从有关信息推测这个基因很大可能性会出表型,建议做KO;另外,研究的目的基因处于非转录区域,或者目的基因有很强的转录效率,也是无法用RNAi进行有效干扰的,则建议做KO,且KO细胞更适合进行回补实验。
  • 最后,敲低跟敲除不是二选一的关系。当我们用RNAi做了基因敲低,观察到细胞表型的变化后,仍然可以进一步做敲除,让实验结论更加有说服性。

 

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  • 常见的KO细胞技术手段及其对应的技术原理、技术特点等
  • 移码突变和片段敲除哪个能更好地破坏目的蛋白的功能结构域?

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