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【文献解读】新型慢性胰腺炎动物模型

胰腺炎是因为胰蛋白酶的自身消化作用而引起的疾病,包括急性胰腺炎、复发性急性胰腺炎和慢性胰腺炎。这些疾病常常引起腹痛、恶心、呕吐、发热等症状,但并没有特异性疗法。

 

以往的研究表明,编码消化蛋白酶或其抑制剂的基因若发生突变,则往往会促进急性胰腺炎的发生,并逐渐发展成慢性胰腺炎。例如,PRSS1(阳离子胰蛋白酶原)、CTRC(胰凝乳蛋白酶C)以及SPINK1(Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂1)的致病突变通过刺激自发激活或干扰保护机制,从而促进胰蛋白酶原转化成有害的胰蛋白酶。

 

不过,基因突变引起的胰腺内胰蛋白酶原自发激活具有直接致病作用,这虽然获得了大量的遗传和生化证据支持,但目前还缺乏适当的动物模型来证实。更重要的是,由于胰蛋白酶原自身激活所驱动的自发性慢性胰腺炎的动物模型的缺乏,这阻碍了针对胰内胰蛋白酶的治疗药物的临床前试验。

 

为此,波士顿大学口腔医学院(Henry M. Goldman School of Dental Medicine)的Andrea Geisz和Miklós Sahin-Tóth开发出一种T7D23A基因敲入小鼠,以填补此领域的空白。这种小鼠携带阳离子胰蛋白酶原(T7亚型)的杂合p.D23A突变,为胰腺炎的研究和治疗提供了出色的模型。这项成果近日发表在《Nature Communications》上。

 

 

T7D23A基因敲入小鼠的开发

 

小鼠基因组包含20个胰蛋白酶原基因。之前的研究表明,只有四种胰蛋白酶原高水平表达,它们分别是:T7、T8、T9和T209亚型。其中,T7亚型占胰蛋白酶原总量的40-50%,并且与其他亚型相比自发激活更快,产生的胰蛋白酶水平也更高。

 

为了产生自发激活增加的T7突变体,研究人员在激活肽中引入了Ala突变,以取代Asp23(p.D23A)。为了在体外测试T7 p.D23A突变体的激活特性,他们纯化了重组野生型和突变型T7胰蛋白酶原,并测定了自发激活。与野生型相比,p.D23A突变体的自发激活显著增加了50倍,此外,他们还测试了溶酶体半胱氨酸蛋白酶(组织蛋白酶B、组织蛋白酶L)对P.D23A突变体的影响,与野生型T7相比,组织蛋白酶介导的p.D23A突变体的断裂没有变化。这一对照实验清楚地证实了p.D23A突变改变了自身激活,而其他胰蛋白酶原激活和降解途径未受到影响。之后,研究人员委托赛业生物(Cyagen)制备了T7D23A基因敲入小鼠,具体是通过C57BL/6胚胎干细胞中的同源重组将p.D23A突变引入小鼠基因组(图1d)。DNA测序表明,这些杂合小鼠在突变位点显示出两个高度相当的峰,表明野生型和突变型等位基因的表达水平相当。新的T7D23A品系未出现明显的表型改变,并且正常繁殖。

 

 

 

T7D23A小鼠出现自发的急性和慢性胰腺炎

 

研究人员对T7D23A小鼠的胰腺形态进行观察,发现2-3周时是正常的,但4-5周时变化较大,而2个月后胰腺明显变小。组织学检测发现,T7D23A小鼠从第3周开始出现典型的急性胰腺炎,在4-5周出现得更加频繁(~40%)。水肿破坏了紧密排列的组织结构,大量炎性细胞浸润,且小叶出现中心局部坏死(图2)。

 

在4-5周时,研究人员发现超过一半的小鼠表现出明显的疾病进展。它们的胰腺切片显示出广泛的再生指征,包括管状复合物出现、胰管扩张扭曲和弥漫性间质纤维化,这些都是早期慢性胰腺炎的特征。从2个月开始并持续到6至12个月,脂肪开始在组织学图像中占据主导地位,而炎性细胞和管状复合物的数量开始减少。在扩张扭曲胰管的周围纤维化更普遍,有时还充满嗜酸性物质,这些是晚期慢性胰腺炎的特征。

 

 

T7D23A小鼠胰腺重量

 

研究人员将T7D23A小鼠的胰腺重量与C57BL/6N对照小鼠进行比较,发现约40%的小鼠在4-5周龄表现出明显增加。这种增加与组织切片上观察到的水肿性急性胰腺炎一致。大约50%的小鼠在4-5周龄时胰腺重量明显减轻,表明早期慢性胰腺炎的出现。所有T7D23A小鼠在2月、6月和12月龄时显示出与晚期慢性胰腺炎相关的胰腺萎缩,与对照小鼠相比胰腺重量减轻约70%。

 

T7D23A小鼠的血浆淀粉酶活检测

 

淀粉酶是诊断急性胰腺炎最常用的指标。因此,研究人员也测定了各个年龄的T7D23A小鼠血浆中的淀粉酶活性。在4-5周时,他们在约40%的小鼠中观察到淀粉酶值偏高,一种急性胰腺炎的迹象,如组织学图片和胰腺重量测量所示。不过,他们在所有研究的小鼠中都不能捕捉到急性胰腺炎的指标。这可能与采样时间和发病年龄有关,也有可能不是所有的小鼠都会发展为急性胰腺炎。

 

T7D23A小鼠胰内胰蛋白酶活性的研究

 

他们以3周龄(无病理变化)、4周龄(急性或早期慢性胰腺炎)和2月龄(晚期慢性胰腺炎)T7D23A小鼠为对象,测定了新鲜制备的胰腺匀浆液中的胰蛋白酶活性。与相同年龄的对照小鼠相比,3周时未检测到胰蛋白酶活性的升高,但在4周时检测到高值。尽管功能性腺泡细胞减少,但在2个月时仍观察到酶活的升高,表明胰腺内胰蛋白酶的激活在整个疾病过程中持续存在。这些结果结合突变p.D23A增加胰蛋白酶原自身激活的事实,支持了胰内胰蛋白酶原自身激活可导致急性胰腺炎的发生及随后发展为慢性胰腺炎的结论。

 

T7D23A,K24G小鼠没有发生胰腺疾

 

为了排除与胰蛋白酶原自发激活无关的疾病机制,研究人员还制备了p.D23A、K24G双突变的小鼠品系,除了带有杂合的T7D23A等位基因,胰蛋白酶原激活位点Lys24也经过突变。这种小鼠在5.5个月时没有出现自发的胰腺病理变化。这个结果提供了令人信服的证据,说明胰蛋白酶原错误折叠等机制并不引起T7D23A小鼠的表型,进一步支持胰蛋白酶原自身激活的致病作用。

 

T7D23A小鼠与人胰腺炎的特征比较

 

研究人员认为,这种新模型概括了人类胰腺炎的临床疾病特点,它总是先发展为急性胰腺炎,然后再发展为不可逆的慢性胰腺炎。不过,他们没有观察到人类经常出现的急性病情反复发作。这种差异可能是由此处所用的胰蛋白酶原突变造成的。

 

研究人员认为,他们展示了第一个由胰蛋白酶原自身激活引起的慢性胰腺炎的临床前小鼠模型,该疾病是由胰腺内胰蛋白酶原自发激活的增加所驱动的。这个模型概括了与基因突变相关的人慢性胰腺炎的显著特征。值得一提的是,尽管T7D23A小鼠出现明显的胰腺病理变化,但它们能够正常繁殖并发育到成年期,这是临床前应用的先决条件。

 

“在概念层面,这个模型提供了直接的体内证据,表明胰蛋白酶原的自发激活可驱动慢性胰腺炎的发作和发展,且治疗方法应针对胰腺内的胰蛋白酶。”研究人员总结道。

 

原文检索

A preclinical model of chronic pancreatitis driven by trypsinogen autoactivation

Andrea Geisz & Miklós Sahin-Tóth

Nature Communications 9, Article number: 5033 (2018)

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