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【文献深度解读】Neuron教你如何一步一步寻找新型标记物


    

哺乳动物皮层一般可以分为六层,第一层包含少量的神经元胞体(其中大部分神经元为抑制性神经元)和第2/3及第5层的锥体细胞的顶端树突簇,也接受来自于皮层下神经元的长距离投射【1】,处于从上到下处理信息的关键位置。目前明确认为抑制皮层第一层的锥体神经元树突来源于皮层深层的生长抑制素能神经元(SST-positive Martinotti)【2】,但是在皮层第一层内部存在稀疏神经元也可以抑制锥体神经元树突,其具体神经元类型不明。

 

近期,德国马克斯-普朗克脑研究所Johannes J. Letzkus研究团队在Neuron杂志上发表Learning-Related Plasticity in Dendrite-Targeting Layer 1 Interneurons文章【3】,找到了上述藏在第一皮层内的神经元类型-Ndnf神经元。

 

【文献深度解读】Neuron教你如何一步一步寻找新型标记物

 

Step 1 RNA测序

寻找区别于其他层,只特定表达在皮层第一层的标志物

 

为了寻求区别于其他层、只特定表达在皮层第一层的标志物,研究人员Elisabeth Abs认为这种标志物需要满足两个条件:第一,在抑制性神经元上高表达;第二在抑制性神经元上的表达量要比兴奋性神经元要高。

 

研究人员利用RNA测序技术进行筛选,结果发现有6个基因在皮层抑制性神经元上富集表达,但是只有Ndnf(Neuron-DerivedNeurotrophic Factor,神经源性神经营养因子)这个基因高水平表达,可以满足上述条件。

 

Step 2 免疫原位杂交

证明Ndnf可作为皮层第一层中间能神经元标志物

 

免疫原位杂交试验进一步发现表达Ndnf的神经元大多数存在皮层第一层,这种分布特点不同于其他类型的中间能神经元(下图)。这些结果表明Ndnf可作为皮层第一层中间能神经元标志物。

 

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Ndnf集中表达在皮层第一层

 

Step 3 动物实验验证

动物实验验证L1 NDNF Ins可以抑制第一皮层内远端锥体神经元树突

 

基于上述结果,研究人员构建了听觉皮层区Ndnf-IRES-CreERT2小鼠,在与Ai9鼠杂交后获得Ndnf-Ires-CreERT2-cre:Ai9 小鼠,在他莫昔芬的诱导下使听觉皮层第一层神经元永久表达番茄红荧光蛋白,标记表达Ndnf的中间能神经元(L1 NDNF Ins),除了在听觉皮层表达外,还在前额叶皮层表达,以此实现特异性研究,该小鼠可作为一种工具鼠被广泛应用于神经科学中。

 

为了进一步的研究,研究人员又构建了Ndnf-IRES-FlpO基因敲入小鼠,其中flp重组酶在内源ndnf位点的控制下表达。该小鼠对L1显示出相似的选择性,并且对将Ndnf阳性神经元标记为Cre line具有相似的选择性和保真度,表明两种小鼠等位基因都是用于回路分析的强大工具。此外,利用病毒逆行示踪发现L1 NDNF Ins接受大脑中多个脑区的突触输入。(Ndnf-IRES-CreERT2和 Ndnf-IRES-FlpO两种基因敲入小鼠由赛业生物构建

 

 

令人意外的是,光激活听觉皮层中第一层表达L1 NDNF INs后第一层中间能神经元、第2/3层椎体神经元和中间能神经元均引起抑制性,其中第2/3层椎体神经元变化最明显。这就表明L1 NDNF Ins可以抑制第一皮层内远端锥体神经元树突,与SST-positive Martinotti神经元发挥类似的抑制作用。

 

Step 4 动物行为学实验

证明L1 NDNF Ins和SST-positive Martinotti抑制作用不同

 

研究人员进一步发现L1 NDNF Ins和SST-positive Martinotti对远端锥体神经元树突抑制作用是不同的,它们可以互补。

 

它们是如何在具体行为中进行互补的呢?研究人员利用经典的条件恐惧记忆模型结合双光子活体钙影像学技术发现恐惧记忆的表达需要L1 NDNF Ins的响应,与此同时第一皮层内远端锥体神经元的抑制性增强。很意外的是,在恐惧记忆表达过程中SST-positive Martinotti神经元并不参与,但是它时刻关注并控制NDNF-INs的感觉反应。

 

结论:

本文发现NDNF可作为皮层第一层中间能神经元的标志物,且该类型神经元可以抑制锥体神经元树突。

 

参考资料:

1. Larkum, M.E. (2013). The yin and yang of cortical layer1. Nat. Neurosci. 16,114–115.

2. Yavorska, I., and Wehr, M. (2016).Somatostatin-expressing inhibitory interneurons in cortical circuits.Front.Neural Circuits 10, 7

3. Harney S C , Anwyl R . Plasticity of NMDA receptor-mediatedexcitatory postsynaptic currents at perforant path inputs to dendrite-targetinginterneurons[J]. Journal of Physiology (Oxford), 2012, 590(16):3771---3786.

 

本文由BioArt编译,赛业生物授权编辑转载。