Nucleic Acids Research:脂肪生成的表观调控机制


    

肥胖和2型糖尿病的全球发病率在过去的30年中显著增加,已严重危害人们的生命健康。脂肪组织被认为与该类疾病相关,因此操纵脂肪细胞的分化和成熟有望用于临床治疗。大量研究已阐明转录和表观遗传(DNA和组蛋白修饰)在脂肪发生过程中的重要作用,但是对于转录后调控如何影响脂肪生成,尚不清楚。

 

近日,华中农业大学的研究人员在这一领域取得了新进展。华中农业大学动物科学技术学院的博士研究生宋彤星和杨阳为并列第一作者,彭健和蒋思文教授为共同通讯作者。他们在《Nucleic Acids Research》上发表了题为“Zfp217 mediates m6A mRNA methylation to orchestrate transcriptional and posttranscriptional regulation to promote adipogenic differentiation”的文章,首次发现了ZFP217直接激活m6A去甲基化酶FTO的表达,并结合m6A阅读蛋白YTHDF2,促进FTO对m6A mRNA的结合,从而促进脂肪细胞的分化。

 

锌指蛋白217(Zfp217)是众所周知的致癌蛋白,在多种癌症中上调,对胚胎干细胞的分化至关重要。值得注意的是,Zfp217将基因转录与新生RNA上的m6A修饰紧密关联,表明Zfp217在协调表观遗传和表观转录组网络中起关键作用。于是,研究人员猜测Zfp217可能通过调节m6A修饰而加速脂肪生成。

 

Zfp217抑制导致m6A修饰的增加

 

为了探索Zfp217在成脂分化中的作用,研究人员首先利用siRNA开展了功能缺失实验。Zfp217的敲低明显阻断了脂肪生成,表现为油红O染色水平下降,以及关键成脂基因PPARγ、aP2、LPL和脂联素的表达水平降低。此外,利用CRISPR-Cas9系统完全敲除Zfp217基因后,3T3L1细胞中的脂肪生成完全被破坏。此外,他们还委托赛业生物(Cyagen)制备了Zfp217敲除小鼠,发现Zfp217+/-小鼠胚胎成纤维细胞的脂肪生成减少。这些结果表明Zfp217对成脂分化有着重要的影响。

 

 

为了筛查Zfp217在3T3L1细胞中的功能,研究人员通过斑点印迹和液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测了mRNA中的m6A修饰。与对照组相比,利用siRNA和CRISPR-Cas9系统处理后,3T3L1细胞中的m6A水平总体上增加(图1)。与野生型细胞相比,Zfp217+/-小鼠胚胎成纤维细胞的m6A修饰也明显增加。这些结果表明Zfp217对细胞m6A RNA甲基化至关重要。

 

Nucleic Acids Research:脂肪生成的表观调控机制

图1. Zfp217抑制导致3T3L1细胞中的m6A修饰增加

 

Zfp217直接激活FTO的转录

 

尽管Zfp217的失活影响了m6A修饰,但Zfp217本身并不是甲基转移酶或去甲基化酶,那么Zfp217如何抑制m6A mRNA甲基化?于是,研究人员检测了与m6A甲基化相关的关键蛋白的表达。有意思的是,Zfp217被敲低后,甲基转移酶METTL3的表达增高,而去甲基化酶FTO的表达降低。进一步的研究表明,FTO的mRNA水平受到Zfp217过表达或敲低的调控。于是,他们想验证Zfp217是否作为转录因子调控FTO的表达。

 

研究人员利用双荧光素酶报告系统来验证Zfp217增强了FTO的启动子活性,而FTO启动子上结合序列的缺失抑制了其活性,说明Zfp217对FTO的直接调控(图2)。同时,FTO拯救了因缺乏Zfp217而造成的脂肪生成受阻,并增加了PPARγ、aP2、LPL和脂联素的表达。这些结果表明,Zfp217作为转录因子与FTO基因的启动子结合,以增强脂肪生成。

 

Nucleic Acids Research:脂肪生成的表观调控机制

图2. Zfp217激活了FTO的转录

 

Zfp217与YTHDF2发生相互作用

 

之前的报道称,Zfp217通过与胚胎发育和肿瘤中的其他蛋白质相互作用而发挥其功能。为了进一步探索Zfp217促进脂肪生成的分子机制,研究人员又开展了免疫沉淀(Co-IP)实验。他们在3T3L1细胞和HEK293T细胞中都发现了Zfp217和YTHDF2之间的特异性相互作用。

 

为了确认亚细胞相互作用,他们分离出细胞核和细胞质组分来测定Zfp217和YTHDF2表达。他们发现,这两种蛋白质都分布在整个细胞中,不过Zfp217在细胞质中的表达比细胞核更多。此外,共聚焦显微镜分析也观察到两种蛋白质同时位于细胞核和细胞质中,表明YTHDF2可能在Zfp217依赖的脂肪生成中发挥特定功能。

 

以往的研究发现,YTHDF2在热应激下可通过抑制FTO活性来维持m6A的水平。于是,研究人员进一步分析了YTHDF2和Zfp217与FTO之间的相互作用。正如预期,FTO和Zfp217的过表达都显示出较低的m6A水平,且YTHDF2阻断了FTO的去甲基化酶活性,而Zfp217作为调控因子,让平衡倾向于去甲基化(图3)。

 

Nucleic Acids Research:脂肪生成的表观调控机制

图3. Zfp217影响了YTHDF2和FTO之间的竞争

 

此外,他们通过m6A RNA pull-down实验证实了FTO和YTHDF2在靶向m6A ssRNA上的直接竞争关系。显然,不与RNA结合的Zfp217干扰YTHDF2的位置,让FTO与RNA结合。后续的实验也证明,Zfp217与YTHDF2发生相互作用,以维持FTO的m6A去甲基化活性。

 

总的来说,该研究证明ZFP217在转录(激活FTO)和转录后(影响mRNA m6A修饰)水平参与脂肪生成的重要作用,并发现创造性的提出了ZFP217影响m6A阅读蛋白YTHDF2和擦除器FTO竞争性结合靶mRNA的作用模型,为深入了解m6A的动态调控过程提出了新的思路。

 

Nucleic Acids Research:脂肪生成的表观调控机制

图4. Zfp217在脂肪生成中调控m6A修饰的示意图

 

这是国际上首次报道RNA表观修饰调控脂肪细胞生成的分子机制,是对脂肪细胞生成调控机制的全新认识,对拓展相关研究领域具有重要意义。