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新型慢性胰腺炎动物模型解读


    

慢性胰腺炎(CP)是一种较为常见但治疗又十分困难的疾病,其特点为渐进的、不可逆的胰腺形态学变化,是一种连续的或复发性的炎症性胰腺疾病。国内外的众多学者围绕该病的诊断、治疗以及发病机理做了大量的研究。


以往的研究表明,编码消化蛋白酶或其抑制剂的基因若发生突变,往往会促进急性胰腺炎的发生,并逐渐发展成慢性胰腺炎。例如,PRSS1(阳离子胰蛋白酶原)、CTRC(胰凝乳蛋白酶C)以及SPINK1(Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂1)的致病突变通过刺激自发激活或干扰保护机制,从而促进胰蛋白酶原转化成有害的胰蛋白酶。此外,慢性胰腺炎的遗传风险也可以通过与胰蛋白酶活性无关的机制来介导,如一些PRSS1突变对胰蛋白酶活性没有影响,但会导致酶错误折叠,引发内质网(ER)应激。同样地,CPA1(羧肽酶A1)突变也在体外引起酶错误折叠,导致CPA1细胞内滞留和降解以及相关的ER应激。


尽管体外观察到的结果支持基因突变引起的胰腺内胰蛋白酶原自发激活具有直接致病作用,支持突变诱导的错误折叠和ER应激,但一直缺乏适当动物模型的证据。这限制了研究人员对疾病机制的了解,也阻碍了新型疗法的临床前试验。接下来就给大家介绍三种近期新报道的CP模型,希望能为你的研究提供参考。


慢性胰腺炎动物模型一:


spink1 基因是慢性胰腺炎的重要致病因子,spink1 突变 c.194+2t>c是中国CP患者最常见的变异。迄今为止,唯一的体内研究集中于纯合Spink1(也称为SpinK3)基因敲除小鼠的表型研究,发现它们在出生后15天内死于广泛性自噬性腺泡细胞死亡。由于80%以上的中国CP患者携带SPINK1 c.194+2t>c变异体杂合子突变,因此研究人员利用CRISPR/Cas基因编辑技术制作spink1突变小鼠(spink1-/-和spink1+/-)。和以往报道一致,spink1-/-小鼠出生后不久就死亡了。同时接受cerulein治疗的spink1+/+和spink1+/-小鼠在第9周时均出现腺泡萎缩和炎性细胞浸润(图1)。值得注意的是在9周时接受cerulein处理的spink1+/−小鼠出现类似于CP的症状。此外SPINK1+/-小鼠自然状态下在13周时出现胰腺纤维化、星状细胞活化等病理变化。该研究证实了杂合Spink1 c.194+2T>C突变在体内的致病性,并首次发现了这种突变在无任何其他因素的协同下直接导致CP。

胰腺形态的变化
图1 SPINK1+/-小鼠在不同年龄阶段胰腺形态的变化(每幅图片的左下角显示了典型的变化,闭合箭头显示蛋白质栓的形成)


尽管如此,研究人员仍注意到并非所有小鼠都会在13周出现典型的慢性胰腺炎症状,造成这一情况的原因可能是杂合Spink1 c.194+2T>C突变部分外显以及观察时间不足。但是,作为进一步探讨慢性胰腺炎发病机制和潜在治疗靶点用途,杂合子Spink1 c.194+2T>C突变小鼠仍不失为一个理想的模型。并且蛋白质栓的存在表明该小鼠模型亦有可能成为研究慢性胰腺炎胰腺钙化形成的新模型。


慢性胰腺炎动物模型二:


研究发现小鼠组织中T7、T8、T9和T209亚型等四种胰蛋白酶原高水平表达,其中T7亚型占胰蛋白酶原总量的40-50%。研究人员试图通过促进T7亚型胰蛋白酶自发激活,从而构建慢性胰腺炎动物模型。在激活肽中引入了Ala突变,以取代Asp23(p.D23A),构建出T7D23A基因敲入小鼠,该小鼠2-3周时胰腺形态是正常的,但4-5周时超过一半小鼠的胰腺变化较大,具体表现为胰管扩张和弥漫性间质纤维化等症状,并且伴有大量炎性细胞浸润,且小叶出现中心局部坏死,类似于慢性胰腺炎的症状(图2)。

基因敲入小鼠
图2.T7D23A基因敲入小鼠的病理性变化


淀粉酶是诊断急性胰腺炎最常用的指标。因此,研究人员也测定了各个年龄的T7D23A小鼠血浆中的淀粉酶活性,结果表明胰腺内胰蛋白酶的激活在整个疾病过程中持续存在。为了排除与胰蛋白酶原自发激活无关的疾病机制,研究人员还制备了p.D23A、K24G双突变的小鼠品系,发现胰蛋白酶原错误折叠等机制并不引起T7D23A小鼠的表型。


最后,研究人员将T7D23A小鼠与人类胰腺炎的特征比较,这种新模型概括了人类胰腺炎的临床疾病特点,它总是先发展为急性胰腺炎,然后再发展为不可逆的慢性胰腺炎。总而言之,他们展示了第一个慢性胰腺炎的临床前小鼠模型,该疾病是由胰腺内胰蛋白酶原自发激活的增加所驱动的。这个模型概括了人类慢性胰腺炎的显著特征。


慢性胰腺炎动物模型三:


PRSS1突变对胰蛋白酶活性没有影响,但会导致酶错误折叠,引发内质网(ER)应激。同样地,CPA1(羧肽酶A1)突变也在体外引起酶错误折叠,导致CPA1细胞内滞留和降解以及相关的ER应激,可能参与慢性胰腺炎的发病进程。研究人员脑洞大开地通过在小鼠Cpa1基因座上携带人CPA1突变p.N256K,构建了CPA1 N256K小鼠,同时,他们还制备出CPA1 null品系作为对照,以区分CPA1蛋白活性丧失或CPA1错误折叠。结果发现CPA1 N256K小鼠可以正常发育和繁殖,但从3月龄起被观察到胰腺偏小,并存在腺泡细胞萎缩和炎性细胞浸润等慢性胰腺炎的标志性病理特征。


最后,为了确定CPA1 N256K品系的组织学变化是否与ER应激标志物升高有关,研究人员分别测定了1月龄、3月龄和12月龄小鼠的伴侣蛋白Hspa5(BiP)和转录因子Ddit3(CHOP)。一系列的实验表明,CPA1突变p.N256K导致酶错误折叠,并引发慢性胰腺炎,同时伴随着ER应激相关的促凋亡转录因子CHOP的上调。CPA1 null小鼠并没有观察到这些病理现象,表明CPA1功能丧失本身并不引起腺泡细胞损伤。


总而言之,这是第一个与消化酶错误折叠和ER应激相关的慢性胰腺炎小鼠模型。它特别适合测试各种环境因素(如酒精、吸烟、高脂饮食)或药物对慢性胰腺炎发生和发展的影响。


本文提到的三种慢性胰腺炎动物模型:Spink1C.194+2T>C突变小鼠、T7D23A点突变小鼠、CPA1 N256K点突变小鼠均由赛业生物构建,这些动物模型的出现为胰腺炎的研究和治疗提供了出色的模型,也提供了一个研究新思路,对于一些体外实验已有结论但还缺乏活体实验证实的基因变异疾病,通过构建携带变异的小鼠模型来进行活体研究不失为一种可行的方法。


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参考文献


1. HeterozygousSpink1 c.194+2T>C mutant mice spontaneously develop chronic pancreatitis,Gut 2019;0:1–2. doi:10.1136/gutjnl-2019-318790


2. AndreaGeisz& Miklós Sahin-Tóth ,A preclinical model of chronicpancreatitis driven by trypsinogen autoactivation,DOI: 10.1038/s41467-018-07347-y


3. Human CPA1 mutation causesdigestive enzyme misfolding and chronic pancreatitis in mice,Gut 2018;0:1–12. doi:10.1136/gutjnl-2018-315994