【上篇】研究冠状病毒，除了热门ACE2靶点外，你还应该关注哪些靶点？

当前，冠状病毒的预防与治疗是科研界与医药界最紧急的研究热点。除了最热门的新型冠状病毒受体ACE2靶点外，还有哪些靶点值得当前冠状病毒研究人员关注呢？赛业生物专家团队成员深入调研与冠状病毒研究有关的靶点，希望能为科研人员提供一些参考。

APN

APN是Aminopeptidase N（氨肽酶N）的简称。在免疫学界，APN通常被称为星形胶质细胞抗原CD13。1989年发现，APN和CD13是相同的蛋白质，APN在许多不同的人类细胞中表达，如巨噬细胞、基质细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞。APN位于细胞膜上，该蛋白参与肽的裂解，病毒感染，内吞作用和细胞信号转导等生物学过程。

1992年，Yeager等人发现了hCoV-229E使用人氨肽酶N（hAPN）作为受体感染细胞导致疾病。到2017年，Wong等探究了hAPN与hCoV-229E受体结合域的结构，该结构表明病毒表面蛋白上三个延伸的RBD环完全负责受体结合，此外，他们还发现这些环是整个病毒基因组中变化最大的区域。在病毒基因组中，这种环状的RBD受体结合域与特异性中和抗体结合的能力不同，对hAPN的亲和力也有所不同。尽管免疫逃逸为这些RBD环的出现提供了解释，但是如何在维持受体结合的同时适应广泛的环变化仍是一个尚未解决的问题，环的变化也有望促进新的受体相互作用的获取，从而促进跨物种的传递。

图1. APN蛋白结构示意图以及APN抑制剂作用的结构区域（引自Sk. Abdul Amin et al. 2018）

最近在蝙蝠、骆驼和羊驼中发现了类似hCoV-229E的冠状病毒，从蝙蝠到人类的传播可能涉及到这些中间宿主。实验表明，在逆转录病毒载体中用hAPN cDNA 转染小鼠NIH3T3细胞与对照组相比，实验组小鼠更容易感染hCoV-229E病毒，研究验证了hAPN作为宿主受体与hCoV-229E结合来使小鼠感染病毒。研究还发现在细胞实验中骆驼CoV-229E也可以以hAPN作为受体。这些病毒可能以结构保守的方式结合其宿主APN。但应注意的是猪α-冠状病毒PRCoV结合猪APN上的位点不同于hCoV-229E结合hAPN的位点。

APN在病毒的生存中起着重要的作用，我们可以通过抑制APN的表达来控制病毒，我们知道APN是hCoV-229E的受体，而且还可以作为肠道致病性冠状病毒的受体，这说明在某种程度上配体的相似性可能跟结构相关，而SARS-CoV和目前的新型肺炎病毒同样都属于冠状病毒，为了对冠状病毒更加了解，也为了应对今后会出现的冠状病毒变异病毒，我们对于其潜在靶点的研究就显得非常重要，ANP作为冠状病毒其中的一种病毒宿主受体，我们对它多一些了解，就多了一种对病毒入侵的制约。

DPP4

二肽基肽酶（DPPs）属于脯氨酸特异的丝氨酸蛋白酶家族，能够从氨基末端切割二肽。DPP4是该家族中最典型的肽酶，也是在ACE2和APN之后，第三个被发现为冠状病毒受体的外肽酶。DPP4是一种多功能的766个氨基酸长的II型跨膜糖蛋白，它以同源二聚体的形式存在于细胞表面，肽酶的二聚化依赖于水解酶结构域和b螺旋桨叶片IV延伸链之间的分子进行连接。因此，MERS-CoV RBD与DPP4的侧向结合不会破坏DPP4的二聚化。DPP4参与多种生物学过程，例如免疫系统的调节，DPP4可从蛋白质以及各种趋化因子的N端区域切割二肽。DPP4还参与T细胞的活化、趋化性调节、细胞粘附、细胞凋亡和致瘤性等过程。DPP4蛋白在不同物种中表现出高氨基酸序列的保守性，包括从幽门螺杆菌和蝙蝠细胞获得的序列，尤其是羧基末端。

研究显示，MERS-CoV S1与人DPP4直接特异性结合，导致中东呼吸综合征的发生。该病毒与宿主结合的模型由MERS-CoV RBD的E382至C585残基，DPP4胞外域的S39至P766残基以及与DPP4的N85，N92，N150，N219，N229，N281，N321和N520残基N端连接的聚糖的胞外结构域组成。DPP4的酶切位点远离MERS-CoV RBD结合位点，类似于ACE2与SARS-CoV RBD结合的结构。

研究者通过对冠状病毒的研究发现，β冠状病毒可能在S蛋白中具有相似的核心折叠结构域，以呈现具有不同结构的外部氨基酸作为病毒受体识别的区域。DPP4作为明确的MERS-CoV感染受体，了解它与MERS-CoV RBD结合的结构特征有利于我们理解病毒和受体的相互作用，并指导MERS-CoV感染的治疗方法以及疫苗的研发。对于2019年爆发的新型冠状病毒SARS-CoV-2感染宿主受体的研究也有着重要的指导意义。

AGO4

Argonaute 4（AGO4）是一种核酸内切酶，可以“切割” RNA，在RNA干扰和短干扰RNA介导的基因沉默中起着不可或缺的作用。基因沉默是调节真核生物基因表达的进化保守机制。在植物中，转录基因沉默（TGS）可以由RNA定向的DNA甲基化（RdDM）介导。RdDM的建立需要通过RNA聚合酶IV（Pol IV）和RNA依赖性RNA聚合酶2（RDR2）生成双链RNA（dsRNA）。dsRNA被Dicer-like 3（DCL3）加工成24个核苷酸（nt）的小干扰RNA（siRNA），然后被装载到AGO4中以形成效应复合物的核心，该复合体将甲基添加到精确的DNA位置。AGO4蛋白是参与RdDM的主要催化成分之一。RdDM在防御植物中的DNA病毒（包括双生病毒）方面起着至关重要的作用。

AGO4可以结合病毒来源的siRNA（vsiRNA）来介导病毒DNA和TGS的甲基化，从而抑制病毒的转录和复制。研究表明，RNA定向RdDM介导的转录基因沉默（TGS）是一种针对双生病毒的天然抗病毒防御。双生病毒（Geminiviruses）是存在于植物中唯一一类具有孪生颗粒形态的单链DNA病毒。

干扰素应答是哺乳动物抵抗病毒至关重要的免疫反应，RNA干扰诱导的抗病毒防御也是非常重要的。AGO4是哺乳动物干扰RNA（RNAi）和小RNA（miRNA）的效应蛋白。于是研究者就开始探索AGO4在哺乳动物细胞中是否也参与了病毒的防御。研究发现，AGO家族中的AGO4的确参与了哺乳动物的抗病毒防御，于是研究者将AGO1-4的抗病毒活性分别进行了验证。研究显示，AGO4缺陷型巨噬细胞对流感感染表现出明显的高敏感性，感染后病毒滴度和病毒RNA水平显著升高，确定了AGO4在哺乳动物抗病毒防御中的重要作用。此外，在AGO4缺陷型巨噬细胞中，EMCV和VSV水平显著增加，同时研究还确认了AGO4在骨髓源性树突状细胞以及小鼠胚胎成纤维细胞中的抗病毒作用，因此研究者认为，AGO4对多种RNA病毒具有独特的抗病毒作用。而一旦研究人员能够找到利用AGO4蛋白质来增强人体自身防御能力的办法，那么至少在理论上讲，病毒感染人类的可能性将大大降低。

图2.  AGO4在哺乳动物细胞中具有抗病毒作用

IFITM3

该基因编码的蛋白质是一种干扰素诱导的膜蛋白。IFITM3参与细胞分化、凋亡、细胞黏附和免疫细胞调节过程，有助于增强对甲型H1N1流感病毒、西尼罗河病毒和登革热病毒的免疫力。研究表明，IFITM3对多种病毒具有抑制活性，包括A型流感病毒，SARS冠状病毒（SARS-CoV），马尔堡病毒（MARV）和埃博拉病毒（EBOV），登革热病毒（DNV），西尼罗河病毒（WNV），HIV-1和水泡性口炎病毒（VSV）；可以抑制流感病毒血凝素、MARV、EBOV GP、SARS-CoV S和VSV G蛋白介导的病毒进入宿主，在液泡ATPase（v-ATPase）的结构稳定性中起关键作用。有报道表明，IFITM3通过ERK 1/2信号通路上调c-myc的表达，促进肝癌的增殖。而且IFITM 3/STAT 3复合物可以促进胶质瘤细胞对宿主的侵袭，并受TGF-β调控。

图3. 四种微型蝙蝠的IFITM3的氨基酸结构（引自Camilla TO Benfield et al. 2018）

在小鼠中，IFITM3可以抵抗流感。除了在呼吸道上皮细胞和心脏等其他细胞类型中起保护作用外，IFITM3还可以保护免疫系统的细胞免受病毒感染，从而使它们能够进行有效的免疫应答。在流感感染期间，IFITM3在肺的树突状细胞中被I型IFN上调，使它们得以存活并迁移至引流淋巴结以呈递病毒抗原。IFITM3随后在引流淋巴结中激活的T细胞上迅速上调，并且由于它们迁移到病毒感染部位而维持了较高的IFITM3表达，从而提供了使它们能够发挥其效应因子功能的生存优势。有趣的是，IFITM3在肺和气道以及脾脏，皮肤和大脑的组织内T细胞中也有表达，表明它促进了病毒在潜在感染部位的存活。因此，在研究中，通过提高免疫效应子群体的存活率和病毒抵抗力，证明了IFITM3在抵抗病毒感染的免疫中的重要性。

图4. IFITM3在各组织的表达量

2011年有研究者证明了IFITM与SARS-CoV的关联，研究显示IFITM蛋白限制了由马尔堡病毒和埃博拉病毒（MARV，EBOV）进入糖蛋白（GP）介导的感染，同时，干扰素-β特异性限制了丝状病毒和甲型流感病毒（IAV）的进入过程。 IFITM蛋白还抑制了MARV和EBOV的复制。研究者进一步证明SARS冠状病毒（SARS-CoV）的复制和由SARS-CoV Spike蛋白介导的入侵受到IFITM蛋白的限制。IFITM限制了多种包膜病毒进入宿主，并独立于病毒受体的表达来调节细胞的嗜性。而SARS-CoV-2与SARS-CoV病毒的序列同源性，让我们不得不预测IFITM可以作为研究新冠状病毒侵袭宿主的一个保护性靶点。

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