病毒未去，何处是出路

4月8日凌晨，有一群比跨年还要积极的人在期盼武汉重启的到来，这是抗击SARS-CoV-2战役中最辉煌的一刻，标志着我国疫情得到有效控制并且经济开始有序复苏。整整76天，我们迎来了胜利的曙光，但国外的疫情却愈演愈烈，呈加速扩散蔓延态势。为了防止输入性病例再次传染，我国各通商口岸以及人流通道均已采取了强有力的措施，可见新冠病毒在对生命构成严重威胁的同时也对各国经济造成了不可挽回的损失。

一、SARS-CoV-2的来源

通过传染病及流行病学调查，以及测序分析和比对，我国科学家发现了SARS-CoV-2最初来源于蝙蝠，但由于蝙蝠与人类的生活环境相隔甚远，要让病毒直接从蝙蝠传到人身上似乎也没有那么容易，于是中间宿主就成了科研界需要证实的课题，穿山甲？蛇？龟壳类？雪貂？猫？众说纷纭。关于猫携带病毒并在猫之间进行新冠传播已经得到实验证实，但是对于猫是否能够将新冠病毒直接传染给人，还需要更进一步的确证。

二、 SARS-CoV-2是什么

SARS-CoV-2是冠状病毒的一个分支，是由四种主要蛋白以及若干辅助蛋白包裹着遗传物质的正链RNA病毒，主要通过S蛋白与宿主细胞受体结合来介导病毒的入侵，决定病毒的组织和宿主嗜性。人类冠状病毒具有很高的基因组核苷酸取代率和重组能力，被认为是目前发展最快的病毒之一，而人类冠状病毒与多种严重程度不同的呼吸系统疾病相关，例如感冒、肺炎和支气管炎。包括此次疫情的罪魁祸首新冠病毒在内，已鉴定出有7种会引起人类呼吸系统疾病的冠状病毒：hCoV-229E、hCoV-NL63、hCoV-OC43、hCoV-HKU1、MERS-CoV、SARS-CoV、SARS-CoV-2。除了呼吸系统外，肠道和神经系统也会受到这些病毒的影响。

SARS-CoV-2内部有一个螺旋对称的核衣壳，包裹着一个大约30kb左右的单链正向RNA基因组，在病毒复制周期中具有三种功能：

● 作为感染周期的起始RNA；

● 作为复制和转录的模板；

● 作为包装成子代病毒的底物。

三、SARS-CoV-2的的附着和侵入

SARS-CoV-2与SARS-CoV以及hCoV-NL63的主要宿主细胞受体都是血管紧张素转化酶ACE2，细胞环境中的低pH值和相关的组织蛋白酶有助于膜融合从而使病毒进入细胞。根据之前的调研，我们发现，跨膜蛋白酶TMPRSS2可以裂解病毒S1/S2位点以激活S蛋白，使非蛋白体病毒进入细胞而导致感染；ADAM17可以通过促进ACE2胞外区的脱落来增强酶活性进而促进病毒与胞质融合；IFITM3通过调节宿主膜的流动性防止病毒包膜与细胞质膜融合，从而阻止病毒入侵；LY6E是糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定的细胞表面蛋白，能够通过调节病毒半融合状态，也可以通过调节细胞骨架的重排，来促进病毒融合并侵入细胞；CD209L（L-SIGN）的多肽区域变体的杂合表达可能会改变病毒与配体的结合能力，而炎性因子同样在SARS-CoV感染中起作用，增加SARS-CoV的易感性。这些宿主受体分子，是病毒与细胞之间非常好的媒介物，于是聪明的病毒就通过各种有利求生的方式附着并侵入宿主。

四、SARS-CoV-2的复制

病毒，是一种介于生命与非生命之间的物质，其本身并没有生命迹象，必须依赖于宿主细胞才能存活。SARS-CoV-2也是一样，利用宿主细胞机制进行自身的复制和传播，它要经历附着、进入宿主细胞、复制酶-转录酶的翻译、基因组复制、mRNA转录以及新病毒的组装等过程。SARS-CoV-2的感染始于S蛋白RBD结构域与其同源受体的附着，S蛋白中S2亚基构象发生改变，促进了病毒和细胞膜的融合。核衣壳释放到细胞质后，病毒基因组RNA（gRNA）通过核糖体移码翻译产生多蛋白pp1a和pp1ab。pp1a和pp1ab由宿主和病毒蛋白酶进行水解处理，生成16个非结构蛋白（NSP），然后组装形成复制酶-聚合酶。复制酶聚合酶参与新型冠状病毒的复制，在该过程中基因组RNA被复制，亚基因组RNA被转录和翻译形成结构蛋白。病毒产物将在高尔基体中组装，并以光滑壁囊泡的形式出芽到脂膜，通过胞吐作用排出。

五、SARS-CoV-2与先天免疫

当细胞暴露于病原体中时，免疫反应防御机制被激活，以细胞依赖性方式调节免疫应答。先天免疫是抵御病毒的第一道防线。宿主和病毒都可以操纵先天性免疫机制，作为防御或逃避的策略形式。免疫系统通过模式识别受体（PRR）来识别并结合病原体。PRR主要分为三类：

1. Toll样受体（TLR）。TLR的激活主要发生在抗原呈递细胞中，例如树突状细胞（DC）、巨噬细胞、单核细胞和B细胞。识别病毒成分以后，TLR募集含有Toll/IL-1受体（TIR）的信号转接分子，例如髓样分化初级反应蛋白88（MyD88）和β干扰素TIR结构域衔接蛋白（TRIF），然后MyD88和TRIF刺激MAPK和NF-κB通路，从而增强IFN和促炎因子的产生；

2. 视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体（RLR）。RLR是一个胞质受体家族，由三个成员组成，一个是RIG-I，一个是MDA5（melanoma differentiatioin associated factor 5），另一个是LGP2 (laboratory of genetics and physiology 2)。RIG-I识别病毒基因组RNA中的5’三磷酸部分，以及通过病毒基因组互补末端的自我退火形成的双链结构，相反，MDA5通常会检测到更长的dsRNA序列。RIG-1和MDA5与病毒RNA的结合会导致构象改变，从而暴露出CARD域，募集定位于线粒体和过氧化物酶体的抗病毒信号转导分子MAVS，MAVS激活转录因子，触发干扰素IFN和促炎细胞因子的表达；

3. 核苷酸寡聚化样受体（NLR）。NLR是PRR中的另一个大家族，LRR基序检测病毒PAMP，以诱导结构重排，随后，MAPK和NF-κB信号通路在内的多种信号通路被激活。同时，炎性小体的组装也是由NLR家族成员介导的，炎性小体激活炎性相关蛋白酶，诱导IL-1β和IL-18前体裂解为活性形式。冠状病毒的感染，与IFN合成的抑制有关。病毒调节I型IFN信号转导的能力是病毒毒力的重要标志，研究表明，冠状病毒的结构蛋白，非结构蛋白和辅助蛋白会改变先天免疫反应。

六、SARS-CoV-2的研究现状

从病毒爆发到现在，已在线发表了上百篇相关的研究论文，科学家们从不同角度对SARS-CoV-2进行探讨，包括病毒的流行病学和传染性特征、病毒的溯源，病毒的基因组结构、病毒的结构与功能解析、病毒与宿主受体的结合、宿主潜在受体的探究、病毒入侵宿主后的免疫反应特征等等，那么接下来，我们来聊一下研究现状：

1. SARS-CoV-2直接破坏人的脾脏和淋巴结

淋巴细胞减少症是感染SARS-CoV-2患者的共同特征，但是这种消耗的机制尚不清楚。研究表明SARS-CoV-2可以直接感染继发性淋巴器官以诱导细胞死亡。免疫组化实验发现，SARS-CoV-2的受体ACE2在脾脏和LN中CD169+巨噬细胞上表达。免疫荧光证实，SARS-CoV-2感染会引起严重的组织损伤，包括淋巴滤泡耗竭、脾结节萎缩、组织细胞增生和淋巴细胞减少。病毒感染导致严重的淋巴细胞凋亡，可触发巨噬细胞产生IL-6，一种直接促进淋巴细胞坏死的促炎因子。因此可以说，SARS-CoV-2通过感染组织直接影响人的脾脏和淋巴。

2. SARS-CoV-2 sarbecev亚属的进化起源导致了新型肺炎COVID-19大流行

美国宾夕法尼亚州州立大学生物系传染病动力学中心研究了COVID-19进化问题：

● 新病毒与SARS的相关性；

● 蝙蝠作为自然病毒库所起的作用；

● 其他哺乳动物的潜在感染性；

● 重组在病毒出现中的作用。

作者发现sarbecoviruses（SARS-CoV和SARS-CoV-2病毒都是这个亚属），出现频繁的重组，但是在SARS-CoV-2谱系本身并没有检测到病毒的重组体。

研究表明，蝙蝠中存在一种单一的血统，其特征使其能够感染人类细胞，如先前针对于第一个SARS-CoV血统相关的蝙蝠sarbecoviruses所述。为了评估该血统在蝙蝠中传播的时间长短，研究者估计了进化到SARS-CoV-2和RaTG13的最近共同祖先tMRCA的时间。用三种生物信息学方法来消除重组的影响，并且结合使用这些方法来确定推定的非重组区域，这些区域可用于可靠的系统发育重建和年代测定。虽然穿山甲可能是促进病毒向人类传播的中间物种，但证据表明，该病毒与蝙蝠中进化产生的蝙蝠sarbecovirus一致，他们可以在人和穿山甲的上呼吸道中复制。

3. SARS-CoV-2的核衣壳蛋白（nCoVN）消除了人诱导多能干细胞（iPSC）的多能性

nCoVN破坏了iPSC的多能性并将其转变为成纤维细胞。逆转录PCR（RT-RCR）结果表明ACE2在iPSC，iPSC衍生的心肌细胞（iPSC CM）和人冠状动脉内皮细胞（HCAEC）表达，表明这些细胞是SARS-CoV-2的潜在目标。同时，nCoVN可能损害生殖系统和造血系统。

4. SARS-CoV-2受体识别的结构基础

近期的研究探索了hACE2结合SARS-CoV-2受体结构域RBD的晶体结构。与SARS-CoV RBD相比，SARS-CoV-2 RBD中的hACE2中的一些残基变化稳定了RBD/hACE2界面上的两个病毒结合热点。SARS-CoV-2 RBD的这些结构特征增强了其与hACE2结合亲和力。此外，作者还显示RaTG13，一种与SARS-CoV-2密切相关的蝙蝠冠状病毒，也使用hACE2作为其受体。hACE2识别SARS-CoV-2、SARS-CoV和RaTG13之间的差异揭示了SARS-CoV-2在动物和人类之间潜在的传播形式。

很多研究表明病毒表面刺突蛋白介导冠状病毒进入宿主细胞，近期的研究阐明了SARS-CoV-2受体识别的结构和生化机制。SARS-CoV棘突蛋白包含一个受体结合域RBD，RBD特异性识别ACE2，研究者之前确定了来自不同宿主的ACE2结合不同毒株的SARS-CoV RBD的一系列晶体结构，表明SARS-CoV RBD含有一个核心和一个受体结合基序（RBM），RBM介导与ACE2的相互作用。hACE2的表面包含两个病毒结合热点，这对于SARS-CoV结合至关重要。

5. 动物模型在SARS-CoV-2病毒性疾病中的应用

对冠状病毒本身以及宿主受体的基出研究，我们已经取得了很多进展，但对于疫苗的开发和抗病毒药物的研制依然没有达到理想的状态，随着科学技术的发展，疫苗开发的方式变得多样化，为我们快速得到有效疫苗争取了时间，同时抗病毒药物的全新开发以及旧药新用，都必须落实到动物水平进行验证。而由于物种间的差异，目前SARS-CoV-2宿主受体蛋白ACE2在各物种之间并不相同，其结合病毒的基序也并不完全一致，研究表明ACE2在猫和人类之间存在差异，在小鼠和人类之间同样存在差异，事实是人源ACE2的hotspot31与hotspot353氨基酸为赖氨酸，而鼠源ACE2却多了一个组氨酸，组氨酸的存在阻碍了病毒与ACE2的结合，也就是说这种差异对病毒入侵是不利的，同样，MEAR-CoV受体靶点DPP4中两个关键氨基酸A288和T330在人和小鼠中是不一样的，因此我们在应用小鼠模型时就必须考虑利用现在的基因编辑技术将受体基因进行人源化，最大限度模拟冠状病毒感染人类的动物模型，然而制备易感动物模型也不是短期内就能够立马实现的事情，而且主要受体也并不是病毒作用的单一方式，也会受到各种酶分子或者免疫调节分子的制约，对于各种潜在影响SARS-CoV-2感染人类的各种相关因素我们仍知之甚少，根据各项调研结果，我们发现针对冠状病毒的研究，潜在靶基因TMPRSS2、ADAM17、CD209L、CD147、AGO4等的功能不能忽略，这些分子不管是从帮助病毒本身入侵机体还是参与病毒与ACE2的结合，均会影响到病毒感染人并发病的生物学过程，而APN、DPP4作为冠状病毒的人类受体，同样具有重要的研究意义。因此，人源化小鼠模型是冠状病毒的研究中必不可少的重要工具。

作为一家专业的有责任感的模式动物服务商，赛业生物自疫情爆发以来便紧急召集公司的研发人员全力研发与新型冠状病毒研究相关的动物模型。目前公司用于新冠肺炎研究、疫苗研发或者新药筛选的动物模型研发正加快推进，同步开展ACE2、DPP4和APN三种冠状病毒关键受体的C57和BALB/c背景品系的人源化模型、基因敲除模型和ROSA26基因敲入小鼠模型。为了能用专业特长为疫情防治贡献一份力量，赛业生物一方面将加快上述三种冠状病毒关键受体基因改造的“基因鼠”和其它更多冠状病毒靶点相关的动物模型的研发，同时启动针对参与湖北省新冠疫情救援的一线科研人员的公益项目，免费捐赠ACE2基因敲除小鼠、ACE2人源化小鼠和ACE2条件性基因敲入小鼠等新冠肺炎病毒研究相关受体小鼠模型，助力防疫攻坚。

对于新型冠状病毒的研究，我们还有很长的路要走，如何寻找出路，无非是找到最合适的疫苗，将病毒消灭在萌芽状态，亦或者制备合适的抗病毒药物，将病毒扼杀在繁殖过程中，了解它，才能战胜它。对于冠状病毒，我想最终它的目的并不是消灭人类，而是与人类和谐相处，但是，它的危害如何？我们人类对它的控制能力如何？有多少把握能够将它掌控在我们的技术范围中？这些都是必须解决的问题。

课程预告

本期课程刘璐博士将为大家解析冠状病毒感染宿主受体热门靶点，下期课程俞晓峰博士将为大家讲解如何选择合适的小鼠模型研究冠状病毒。参与课程互动还有机会抽中以下精美礼品一份：小米手环或华为耳机，快来报名参加课程吧～

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参考文献：

1. Yvonne Xinyi Lim, Yan Ling Ng, James P. Tam and Ding Xiang Liu. Human Coronaviruses: A Review of Virus–Host Interactions. Disease. 2016.

2. Zeqing Feng, Bo Diao, Rongshuai Wang et al. SARS-CoV-2 infects human splees and lymph nodes. medRxiv preprint. 2020.

3. Maciej F Boni, Philippe Lemey, Xiaowei Jiang et al. Evolutionary origins of the SARS-CoV-2 sarbecovirus lineage responsible for the COVID-19 pandemic. BioRxiv preprint. 2020.

4. Lin Zebin, Gao Qiang, Fang Qian et al. The nucleocapsid protein of SARS-CoV-2 abolished pluripotency in human induced pluripotent stem cells. BioRxiv preprint. 2020.

5. JianShang, Gang Ye, Ke Shi et al. Structural basis of receptor recognition by SARS-CoV-2. Nature. 2020.

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