您所关注的阿尔茨海默病学习记忆相关行为学疑问，都在这里!

7月23日晚上七点，赛业生物云课堂开展了主题为“阿尔茨海默病学习记忆相关行为实验概述”的课程，需要课件的老师可以关注“赛业生物订阅号”，后台留言“006”。针对答疑环节未及时解答的问题，我们进行了收集整理，下文为黄颖博士针对答疑环节提出的问题给出的详细解答。

Q1: 行为学表现与预期不同时的处理方法？

A: 我不知道您说的预期是指阳性对照和阴性对照之间没有检测出差异，还是处理组差异，我先假设您阳性对照和阴性对照是有差异的，造成检测组没有差异的可能无非有5种：①本来处理组就没有明显作用（这个需要文献或者是把实验做到极致才能确定）；②N不够，没有统计差异（加N）；③实验难度过高，造成地板效应（降低难度，如缩短训练和检测之间的时间等）；④实验难度过低，造成地板效应（提高实验难度）；⑤组内变异太大（小鼠年龄，性别等的统一）。

Q2: 水迷宫实验时要提前对动物进行初筛，排除异常行为或视力的动物吗？

A: 年轻的动物一般可以不用初筛，而年老（12个月以上）则需要对动物的视力和异常行为进行检测。不过一方面平台可见期的实验除了对动物进行运动能力和视力的检测以外，还有帮助小鼠确定水池中有逃生平台，帮助其下水后尽早确立行动目标，所以个人认为最好提前做。

Q3: 造模中动物的死亡问题？

A: 这个问题我理解为行为实验时动物的死亡。这主要涉及动物的年龄和转入/编辑基因的状态，水迷宫实验要特别注意水温以及游泳完成后小鼠的保温，如果是电刺激相关的实验，需要降低电刺激持续的时间。基因编辑动物需要注意文献中报道的小鼠生存曲线。

Q4: 常用模型都有哪些，可以做什么行为学实验？评价指标是什么？

A: AD四大模型：Tg2576，APPPS1△E9，5×FAD，3×Tg。

主流行为实验包括：水迷宫，新物体识别，Y/T迷宫，巴恩斯迷宫，放射迷宫，恐惧记忆箱。AD还会做一些情绪相关实验，如矿场，高架迷宫等。

Q5: 在行为学实验中通常使用什么行为实验，各有什么优缺点，和实验的注意事项？

A: 1. 水迷宫

优点：驱动力强，可获得数据多，不用每次换小鼠清洗设备，认可度高；缺点：小鼠应激性较强，设备搭建和数据分析要求较高，年老小鼠容易中途死亡。

2. 新物体识别

优点：设备搭建相对简单，可获得数据较多，小鼠应激性小；缺点：物体选择需要谨慎，驱动力较弱，易受环境影响。

3. Y迷宫

优点：设备搭建简单，实验种类较多，小鼠应激性小老少咸宜（非饥饿驱动）；缺点：清洗麻烦，随机性较大。

注意事项请关注赛业生物公众号，我以后会在推文里进行详细的介绍。

Q6: 阿尔茨海默病动物模型的建立及判断成功建立的标准？

A: 最高标准：分子（Aβ沉淀和NTF），细胞（易感区域神经元死亡，突触丢失），组织（脑容量减少），电生理（突触可塑性改变），行为（记忆认知减退）。前4个项目中任意两种加上行为改变就算成功了，当然你也可以对自己提出更高的要求。

Q7: 水迷宫实验的结果如何统计分析？

A: 具体可参考Nature Protocol，里面有很详细的说明《Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory》。

Q8: 新物体识别y迷宫行为学实验注意的问题？

A: 具体可参考《The Y-Maze for Assessment of Spatial Working and Reference Memory in Mice》。

Q9: 目前已有model的bug，创建新型model的突破点在哪？

A: 主要的bug在于是转基因。因为以目前的眼光来看转基因属于比较粗糙的基因编辑技术，拷贝数不定，插入位点随缘，启动子过于强大，双/多转基因只重病理表型，对致病的根本原因重视不够；所以，理论上而言，目前最理想的基因编辑方式应该是KI（同时避免随机插入和过量插入），而且只能改变一个家族性AD基因（因为家族性AD中没有同时APP和PS1发生突变的），启动子用人/鼠自身的启动子（尽量使表达调控方式一致），而且除了小鼠外可以尝试大鼠（大鼠的MAPT产物剪切方式和人类一致性高，而且比小鼠更适合行为实验）。但是目前的问题在于KI大/小鼠表型都很弱，进而造成相关研究较少。

Q10: 不同模型的适应阿尔兹海默症治疗药物的区别，不同行为学的统计分析？

A: 这是个大问题，药物和AD模型的排列组合太多了，每种AD模型连表型都没有完全统一，这个问题抱歉没法回答。两组比较用T-test，学习曲线比较用two-way ANOVA，具体建议可参考nature protocol或者JOVE中的详细介绍。

Q11: 小鼠的触屏行为也可以做AD，咋没提到呢？

A: touch screen system是在2000年以后发明的，这次介绍的是近20年使用频率最高的四种AD相关行为学实验，而TCS目前在AD中的论文数量与这四种还相距甚远，不过如果同学感兴趣我们可以下次安排介绍剩余的行为学习记忆实验方法。

Q12: 探索期是从几号放进去的？（水迷宫最后探索期在几号数字放下去的）

A: PPT中的方案是从平台象限正对的位置放入（这个位置在训练期是没有用过的），不过我讲的方法只是我自己认为比较好的水迷宫流程，目前也有其他的小鼠入水方案。

Q13: 周龄对行为学结果的影响？

A: 性成熟后两周开始，小鼠身体各个方面进入最佳状态，这个期间小鼠均一性好，年龄越大除了运动和认知能力整体减弱以外，由于生长过程中积累的变量不同，差异也变大。此外，动物实验的每组小鼠不多，会增加组内差异。

Q14: 新物体识别小鼠探索物体的总时间15s左右需要剔除吗？观察时间5min？

A: 有很多实验就是设置的15s探索时间，只要标准统一，15s也是常用的参数。观察时间上限我们一般设置为5分钟，5分钟和10分钟都是主流时间，不过个人觉得5分钟就够了，不喜欢探索的小鼠即便你多等5分钟也意义不大。

Q15: 条恐freezing%阈值的选择 ，及结果的分析？

A: FC是集成度最高的设备，不同的设备对应不同的软件，很多FC设备都是自带软件的，所以Freezing的阈值设置也有所区别，一般都是有一个移动的范围和持续时间作为判断是否僵直的参考（比如小鼠在间隔为100ms的采样频率下，连续2s每帧画面的移动范围不超过5%），但是又需要通过一些算法过滤掉呼吸引起的动作，所以一般需要参考不同软件的说明进行设置。

Q16: 同一批小鼠可以把行为学都做了吗？

A: 可以，但是不同的行为学之间最好间隔两周以上，同时电刺激相关会让小鼠产生应激性的实验应该尽量放在行为实验的最后进行，NORT一般可以做2次，我们实验室以前一般是在8-9月龄时做一次NORT，18-22月龄时再做一次。

Q17: App Ps1两转鼠Aβ和Tua出现的时间？

A: 前者6-7个月出现，没有tau形成的NTF。

Q18: 恐惧箱的声音刺激55Hz够吗？箱体风扇的白噪音都有60Hz以上？

A: 我在课程里讲的是引用了2014年JOVE文章中的设置。重点是作为Cue的声音强度要和作为背景的声音强度有明显区别，强度单位是db，声音频率的单位是Hz，这两个意义不一样哦。

Q19: ymate需要对每个臂标记下吗？

A: 需要，因为严格的Y迷宫实验中每个臂都要轮换着用，所以需要标记以确保每个臂都会用到。

Q20: Y迷宫可以用人工分析吗？

A: 可以，Y迷宫相对其他行为学而言因为只有次数和时间，可以人工分析，但一定要录视频。

Q21: 可以在同一天做Y迷宫跟旷场实验吗？

A: 没有足够的证据说明不能，但是一般原则是不同行为学实验最好不要在一天做。我个人的理解是如果Y迷宫不是禁食的那种，且两个实验加起来8小时内就能完成，没问题，如果需要超过12个小时，时间跨度太大，对小鼠的节律有影响。

Q22: 新物体识别，分析怎么取数据？

A: 具体可参考课件P22。

Q23: 新物体识别怎么分析，都自己手动计时？

A: 能用软件就用视频分析软件吧，手动计时主观性太高，严格来说，手动计时需要双盲。

Q24: 水迷宫是不是需要做路径分析？

A: 是的，虽然会多花一些时间，但路径分析的意义在于即便小鼠在找到平台的用时方面没有区别，但如果路径有区别也是能说明问题的，给自己多留条路比较好，而且Reviewer也经常会问的。

Q25: 水迷宫水温的影响？

A: 水温高，驱动力不够，小鼠可能选择漂浮；水温低小鼠热量丧失快，应激反应强，容易病或死。但是对于年老小鼠（16个月以上）需要参考其他文献中的水温设定稍微提高一点。

Q26: 请问上午下午做实验有区别吗？

A: 有区别，但是要看什么实验，刺激越强的实验区别越小。实验尽量在8小时内完成，小鼠太多最好分批做，接近小鼠休息的时期或者小鼠刚休息完就进行实验小鼠状态的均一性较差（想想你自己上午和下午状态是不是一致的）。

Q27: 能不能再讲讲APOE4人源化的小鼠模型，会有认知症状么？

A: 单独APOE4并不会引起AD的病理表型，但也有报道说APOE4人源化小鼠有轻微的认知症状，不过其对照是APOE3 KI（Interaction of ApoE3 and ApoE4 isoforms with an ITM2b/BRI2 mutation linked to the Alzheimer disease-like Danish dementia: Effects on learning and memory），且大部分文章并没有发现APOE4小鼠有认知症状。

Q28: 新物体识别可以间隔多久再给动物重复做？

A: 做完一个长时程和一个短时程的试验后一般最少两周以后才可以做，除非有什么特别的理由，物体也不要用上次实验用过的物体。

Q29: APP转基因小鼠在实验中会无故死亡么？

A: AD转基因小鼠本来死亡率就高于同窝野生型，比如APPPS1δ9一般准备试验用鼠时杂合子就要比野生型多准备20%，注意AD小鼠最初开发时几篇原文中的生存曲线，具体到不同的AD鼠略有不同，请根据自己所选择的AD鼠查询文献或者咨询供货商。

Q30: 行为学软件分析目前做到什么水平了？

A: AnyMaze和Nudols都是很好的行为学分析软件，主要是分析迷宫类视频中的实验数据，摄像设备的设置和动物环境对比是很重要的准备工作，具体官方网站有详细介绍。国产也有很多，功能大同小异，只是具体动物运动识别能力可能会根据算法的差异存在区别。

Q31: 新物体识别，现在有统计20s阈值内探索时？

A: 问题貌似没问全，两个物体一共探索20秒就停止实验，不过一般会设定探索时间上限，比如10分钟内没有探索到20s的小鼠就不计入统计。

Q32: 3xTg AD模型，NFT怎么染色，有成熟的方案或者试剂盒吗？

A: 有P-tau的抗体。具体见https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=MAPT#proteins.

Q33: 还想问问Y迷宫不是从同一条壁放的有影响吗？

A: 无论是对自主交替这种无需饥饿诱导的实验还是对检测短时工作记忆的饥饿诱导实验来说，严格的话本来就是应该从不同的臂放入去平衡不同臂可能带来的差异。

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