重庆大学吴海波课题组揭示结核分枝杆菌免疫逃逸的新机制

如今，结核病仍是世界头号的传染病杀手。2018年，全世界估计有1000万人新患上结核病，并有150万人因此丧生。引起结核病的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）通过呼吸道入侵人体并引起肺部病变。通常，宿主的免疫系统会识别并清除结核分枝杆菌，以防止感染的进一步扩散。然而，这种细菌并不是那么容易对付的，它会想方设法逃避宿主免疫系统的监视。至于它是如何逃逸的，现在人们还没有完全弄清楚。

重庆大学吴海波课题组近日通过调节宿主miR-325-3p的表达，发现了结核分枝杆菌新的免疫逃逸途径。这不仅有助于了解结核分枝杆菌的免疫逃逸，还为耐药结核病的疗法开发提供了理论基础。这项成果于2020年6月发表在mBio杂志上。

01 miR-325-3p与结核分枝杆菌的存活有关

吴海波课题组之前的研究表明，小鼠被结核分枝杆菌气溶胶感染后，microRNA-325-3p（miR-325-3p）的表达上调。同样地，他们发现与健康对照相比，潜伏性结核病患者的miR-325-3p水平更高，表明这种miRNA在结核分枝杆菌的存活中发挥重要作用。

为了确定miR-325在结核分枝杆菌感染中的作用，研究人员首先以感染结核分枝杆菌的RAW 264.7巨噬细胞为对象，分析了miR-325转录本的表达水平。他们发现，pri-miR-325、pre-miR-325和miR-325-3p的表达水平在感染后均增加。同时，小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）在感染后24小时也观察到miR-325-3p的上调。

之后，他们又用miR-325-3p模拟物和抑制物来转染RAW 264.7细胞。结果表明，在模拟物存在时，结核分枝杆菌的存活率得到了提高。相反，经过抑制物处理后，结核分枝杆菌的存活受损。与野生型小鼠相比，Mir325敲除小鼠在感染结核分枝杆菌后的中位生存期显著延长。这些数据表明，miR-325-3p在结核分枝杆菌感染后上调，且不利于宿主形成对结核分枝杆菌的抵抗力。

02 LNX1是miR-325-3p的直接靶点

接下来，研究人员分析了miR-325-3p在结核分枝杆菌感染期间是否靶向和调节特定的基因。他们通过数据库预测了miR-325-3p的靶点，并选择Lnx1开展进一步的研究。Lnx1的3’ UTR中含有miR-325-3p的特异性结合位点。他们将Lnx1的3’ UTR及其突变体克隆到荧光素酶报告载体后，与miR-325-3p模拟物一起转染到HEK293T细胞中。他们发现野生型3’ UTR中的荧光素酶活性下调，而突变体则没有下调。

为了进一步证实miR-325-3p在调节LNX1中的作用，研究人员又通过Western blotting评估了LNX1的表达水平。结果显示，LNX1在miR-325-3p模拟物存在时受到抑制，而在miR-325-3p抑制物存在时上调。他们接着用γ射线照射的结核分枝杆菌来感染野生型小鼠的BMDM细胞以及RAW 264.7细胞，发现感染阻止了两种巨噬细胞中LNX1的表达，但来源于Mir325缺陷型小鼠的BMDM中却未出现这种现象。这些结果表明，miR-325-3p靶向LNX1，抑制其在结核分枝杆菌感染期间表达。

03 LNX1促进NEK6的多聚泛素化

那么，LNX1在结核分枝杆菌感染期间发挥了什么样的作用？研究人员首先利用酵母双杂交系统来筛选LNX1的相互作用蛋白。通过软件预测和Western blotting筛选，他们选择了NEK6，这是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在几种组织中普遍表达。他们发现，NEK6的变化与LNX1呈负相关。体外和体内的实验均表明，LNX1是NEK6的负向调控分子。

之后的免疫共沉淀和体内pulldown实验结果表明，LNX1与NEK6之间存在着直接的相互作用。他们还发现，miR-325-3p过表达抑制了NEK6-LNX1相互作用，而miR-325-3p抑制则增强了这种相互作用。由于LNX1与NEK6之间存在反向关联，故研究人员分析了LNX1存在或不存在时的NEK6多聚泛素化。后续研究表明，LNX1是一种E3泛素连接酶，它直接与NEK6结合，并促进NEK6的多聚泛素化以及蛋白酶体介导的降解。

04 NEK6通过激活STAT3而抑制细胞凋亡

接下来，研究人员进一步研究了NEK6在结核分枝杆菌存活中的特定作用。由于NEK6是一种靶向STAT3的蛋白激酶，因此他们首先关注了结核杆菌感染期间STAT通路的调控。在感染24小时后，STAT3的磷酸化水平上调。而Nek6敲除小鼠（赛业生物构建）的BMDM和器官中则表现出相对较低的STAT3磷酸化水平。

众所周知，STAT3是一种转录激活因子，可响应细胞刺激介导多个基因的表达，在许多细胞进程（如凋亡和免疫应答）中起关键作用。因此研究人员测试了下游可以直接由STAT3调控的基因。野生型小鼠的BMDM在被结核分枝杆菌感染期间，抗凋亡BCL-2基因家族的表达上调，而Nek6敲除小鼠的BMDM则没有这种现象。因此，NEK6充足的巨噬细胞表现出凋亡抑制作用，这有利于结核分枝杆菌在细胞内存活。如此看来，NEK6通过STAT3的磷酸化调控先天免疫应答，并参与结核分枝杆菌感染期间的细胞凋亡调控。

综上所述，研究人员通过调节宿主miR-325-3p的表达而发现了结核分枝杆菌新的免疫逃逸途径：miR-325-3p靶向LNX1并阻碍了巨噬细胞中NEK6的蛋白酶体降解，NEK6的异常积累导致STAT3信号的激活，从而使细胞凋亡受到抑制，并促进结核分枝杆菌在细胞内存活。

miR-325-3p促进结核分枝杆菌免疫逃逸的示意图

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原文检索：

Fu B, Xue W, Zhang H, Zhang R, Feldman K, Zhao Q, Zhang S, Shi L, Pavani KC, Nian W, Lin X, Wu H. 2020. MicroRNA-325-3p facilitates immune escape of Mycobacterium tuberculosis through targeting LNX1 via NEK6 accumulation to promote anti-apoptotic STAT3 signaling.

DOI：https://doi.org/10.1128/mBio.00557-20.

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