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赛业生物基因编辑小鼠助力心脏缺血再灌注损伤机制研究

冠心病是严重威胁人类健康和生命的重大疾病之一,其发病率、死亡率逐年升高,其中急性心肌梗死是冠心病中致死及致残率最高的一类疾病。尽管介入治疗的广泛开展,治疗缺血及再灌注(ischemia/ reperfusion, I/R)损伤的心肌仍是尚未解决的难题,大量患者在急诊介入治疗后一周内出现急性心衰、恶性心律失常、甚至死亡。

 

lncRNA,是指长度大于200核苷酸的非编码RNA。大量研究表明,lncRNA参与了从基因表达到蛋白质翻译和保持蛋白稳定等细胞机制,在发育、机体内平衡和维持细胞命运中发挥重要作用。研究表明,lncRNA是多种心脏疾病(包括心脏I/R损伤)的关键调节因子。大量lncRNA已被确定为心脏I/R损伤的重要决定因素,主要是通过与心脏损伤相关的miRNA产生作用。尽管对这种病理过程的分子机制的理解在不断进步,但迄今为止尚未验证任何针对靶点的特异性疗法,并且缺血后再灌注损伤的治疗仍是支持性的。迫切需要进一步探索心脏I/R损伤的机制并确定潜在的治疗靶点。

 

近日,哈尔滨医科大学潘振伟、杨宝峰团队在Nature Communications在线发表题为“The long noncoding RNA lncCIRBIL disrupts the nuclear translocation of Bclaf1 alleviating cardiac ischemia–reperfusion injury”的文章,发现了一种在心脏I/R损伤中起着重要作用的lncRNA——lncCIRBIL。该研究揭示了lncCIRBIL在心脏I/R损伤中的作用及其潜在的分子机制。

赛业生物基因编辑小鼠助力心脏缺血再灌注损伤机制研究

 

LncRNA对心脏发育和各种病理过程(例如冠状动脉疾病、心肌梗塞和心力衰竭)至关重要。lncRNA在心脏缺血损伤中的特定作用一直是心血管研究领域的重点。为了鉴定参与心脏I/R损伤的lncRNA,研究人员筛选了lncRNA在心脏I/R小鼠模型心脏中的差异表达水平,并发现lncRNA NONMMUT058343被显著下调。为方便起见,研究人员将lncRNA UT058343命名为与心脏损伤相关的抑制bclaf1的lncRNA(lncCIRBIL)。

 

为了探索lncCIRBIL在心脏I/R损伤中的作用,研究人员委托赛业生物构建了lncCIRBIL心脏特异性过表达小鼠(IncCIRBIL Tg),并建立了心脏I/R损伤的小鼠模型。与野生型对照相比,lncCIRBIL Tg小鼠中lncCIRBIL的表达显著增加(图1D)。LncCIRBIL的过表达显著降低了I/R小鼠心脏的梗塞面积(图1E),并改善了心脏功能。研究人员进一步探讨了lncCIRBIL对缺氧复氧(H/R)诱导的小鼠心肌细胞损伤的调节。与体内实验一致的是,结果都表明了lncCIRBIL是抗心脏I/ R损伤的心脏保护性lncRNA。

图1. lncCIRBIL的心肌细胞特异性转基因过表达减轻了心肌缺血再灌注损伤

图1. lncCIRBIL的心肌细胞特异性转基因过表达减轻了心肌缺血再灌注损伤

 

为了调查lncCIRBIL的下调是否对心脏有害,研究人员委托赛业生物构建lncCIRBIL敲除小鼠来评估lncCIRBIL的缺乏对心脏损伤的影响。结果表明小鼠lncCIRBIL的敲除加重了心脏I/R损伤。与此一致的是,研究人员测试了lncCIRBIL基因敲低在H/R诱导中的作用体外心肌细胞损伤,结果也表明lncCIRBIL的下调对心脏I/R损伤有害。

 

为了研究lncCIRBIL对心脏损伤的影响的潜在机制,研究人员进行了RNA pull down以筛选可以结合lncCIRBIL的蛋白质,RNA免疫沉淀(RIP)分析也证明了lncCIRBIL直接与Bclaf1结合。Bclaf1最初被发现是一种与Bcl2相互作用的蛋白质,该蛋白质主要位于细胞核中,可以被Bcl29隔离到细胞质中。随后的研究表明Bclaf1可以通过直接激活p53的转录来诱导凋亡。在培养的结肠腺癌细胞中,Bclaf1过表达会增加促凋亡蛋白p53和Bax17的水平。与之一致的是,研究人员通过一系列的实验证实了Bclaf1是心脏I/R损伤中的有害分子。Bclaf1上调心脏I/R损伤过程中p53和Bax的表达,并增加核中Bclaf1的水平,这表明Bclaf1易位到核中以激活p53和Bax表达是导致心脏I/R损伤的必要步骤。这是Bclaf1的功能及其在心脏I/R损伤中潜在机制的第一个证据。

 

此外,在与Bclaf1结合后,lncCIRBIL改变了Bclaf1的细胞分布。lncCIRBIL的过表达限制了细胞质中的Bclaf1,而敲除lncCIRBIL则将其保留在细胞核中。这是Bclaf1核易位的另一个证据,这是由于lncCIRBIL的下调引起的心脏I / R损伤的关键过程,是心脏I/R损伤的发病机制。rescuing experiments证实了这一观点,即部分敲除Bclaf1可以防止lncCIRBIL敲除对心脏I/R损伤的有害影响。同时,lncCIRBIL不会改变Bclaf1的蛋白表达,表明lncCIRBIL与Bclaf1的结合不会影响Bclaf1的翻译或稳定性。

 

总而言之,该研究表明lncCIRBIL和Bclaf1是心脏I/R损伤的关键调节因子。LncCIRBIL通过将Bclaf1隔离在细胞质中并防止其发生核易位以激活核中的p53转录活性而发挥其有益作用。

图2.  lncCIRBIL对心脏缺血/再灌注损伤的作用机制示意图

图2. lncCIRBIL对心脏缺血/再灌注损伤的作用机制示意图。导致I/ R或H/R损伤恶化的正反馈调节通路:I/R或H/R→lncCIRBIL↓→Bclaf1↑→p53↑→lncCIRBIL↓→I/R或H/R 损伤↑。

 

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