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BRGSF重度免疫缺陷小鼠的独特应用优势之一:CAR-T细胞免疫疗法的有效性和安全性评估

CAR-T细胞免疫疗法的有效性和安全性评估

 

BRGSF小鼠背景

BRGSF(BALB/c Rag2tm1Fwa Il2rgtm1Cgn SirpαNOD Flk2tm1lrl)小鼠是目前市面上免疫缺陷程度最高的小鼠之一:Rag2和Il2rg基因的敲除使BRGSF小鼠T、B、NK细胞缺失; SIRPαNOD抑制了小鼠巨噬细胞对人源细胞的吞噬作用;Flk2-/-基因的敲除使小鼠髓系细胞组分(特别是树突状细胞,DC)大幅减少(图1)。这种免疫系统上的高度缺陷使BRGSF小鼠对各类CDX和PDX移植物高度兼容,移植效率高,非常适合抗肿瘤药物的药理和药效学研究。此外,与N*G小鼠(NOD遗传背景:补体C5-/-)不同,BRGSF小鼠为BALB/c背景,其体内存在完整的补体系统,是研究补体依赖的细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity,CDC)的有力工具。例如:对利用CDC机制按需清除CAR-T的药物进行有效性和安全性评估。

图1. BRGSF重度免疫缺陷小鼠

图1. BRGSF重度免疫缺陷小鼠

 

CDC机制

补体(complement)是一种经活化后具有酶活性的血清蛋白,主要由肝细胞和巨噬细胞产生,参与机体炎症反应以及抗微生物的免疫反应。补体依赖的细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity,CDC)是指补体系统被激活后,在靶细胞膜表面形成攻膜复合物(membrane attack complex,MAC),通过在细胞膜上穿孔,最终导致细胞溶解的细胞杀伤效应。补体活化有三种途径:经典途径、MBL途径和旁路途径(图2)。而这三种途径都需要补体5(C5)的参与,才能最终形成由C5b6789(C5b-9)组成的MAC。NOD遗传背景的小鼠C5基因缺失,体内补体系统不完整,无法发挥CDC功效。与之相反,BRGSF小鼠为BALB/c背景,其体内存在完整有效的补体系统,是研究CDC的有力工具,可用来对利用CDC机制发挥疗效的药物进行有效性和安全性评估。

图2. 补体活化的三条途径

图2. 补体活化的三条途径[1]

 

CAR-T细胞免疫疗法简介

CAR-T细胞免疫疗法是一种利用人体自身免疫系统来攻击肿瘤细胞的新型抗肿瘤疗法。自2017年底,FDA批准了两款靶向CD19的CAR-T疗法(Novartis公司的Kymriah和Kite/Gilead公司的Yescarta)上市后,2020年7月,来自Kite/Gilead公司的靶向CD19的CAR-T疗法Tecartus也获批上市。而最近(2021年2月5号)我们又迎来好消息:FDA宣布批准了由百时美施贵宝(BMS)旗下Juno Therapeutics公司开发的同样靶向CD19的第四款CAR-T疗法Breyanzi上市,用于治疗复发性或难治性弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。

 

目前,CAR-T细胞免疫疗法主要通过对分选出的患者T细胞进行基因修饰改造,使其表面表达肿瘤特异性嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR),经体外扩增培养后回输到患者体内来达成肿瘤治疗目的(图3)。这种疗法结合了抗原抗体高特异性和高亲和性的优点,以及T细胞的杀伤作用,可以靶向杀伤肿瘤细胞。但与此同时,一些因素也阻碍着CAR-T疗法的进一步发展,包括细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome,CRS)和神经毒性等CAR-T疗法的常见毒副作用。其中,CRS是一种可致命的急性全身性炎症反应,由活化的免疫细胞大量分泌促炎性细胞因子所引起,因此,它也可看做是CAR-T疗法有效性的一种体现。

图3. CAR-T细胞免疫疗法流程示意图

图3. CAR-T细胞免疫疗法流程示意图[2]

 

Case study:利用CDC机制按需清除CAR-T细胞

为了在不降低CAR-T疗法有效性的同时,避免其毒副作用对患者身体带来严重伤害,研究者们希望可以找到一种能对CAR-T细胞“召之即来,挥之即去”的方法 -- 在CAR-T细胞发挥疗效后,快速按需清除它们。

 

2018年,法国生物制药公司Cellectis的科学家们在Scientific Reports上发表了一篇关于利用CDC机制按需清除CAR-T细胞的论文:A Versatile Safeguard for Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapies。文章介绍了一款他们设计的集检测(detection)、纯化(purification)和按需清除(on-demand depletion)三功能于一体的CAR-T细胞 -- CubiCAR-T,来治疗多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)。

 

这款CubiCAR-T细胞的CAR里包含了抗B细胞成熟抗原的单链抗体(anti-BCMA ScFV)-- BCMA是广泛存在于多发性骨髓瘤细胞表面的一种重要治疗靶标;CD34表位(epitope) --与抗CD34单抗结合,用于CAR-T生产过程中细胞的检测与纯化; 还有CD20模拟表位(mimotope)-- 可与抗CD20的利妥昔单抗(Rituximab,RTX)特异性结合,利用CDC机制按需清除细胞(图4)。CD20在cubiCAR-T细胞中起到了“安全开关”的作用。

图4. CAR结构设计方案

图4. CAR结构设计方案[3]

 

体外实验显示,CubiCAR-T细胞的清除动力学取决于加入的RTX浓度(图5)。在补体和50µg/mL RTX的存在下,CubiCAR-T细胞的半衰期约为10分钟,而这个浓度比报道的患者RTX血药峰浓度(Cmax)低约10倍[4]

图5. 通过补体清除CubiCAR-T细胞的动力学

图5. 通过补体清除CubiCAR-T细胞的动力学[3]

 

在2×105个CubiCAR-T细胞中加入不同浓度的RTX(10-100µg/mL)和补体,或不做处理。

细胞相对活性(relative viability) = 经过处理的细胞活性/不做处理的细胞活性×100

 

为了进一步在中验证CubiCAR-T细胞的有效性以及验证其可被RTX特异性清除,研究人员者们选取了BRGS小鼠进行体内实验(图6)。这款小鼠与其“升级版”BRGSF小鼠一样,缺乏T、B、NK细胞,巨噬细胞对人源细胞吞噬作用弱,而且存在有功能的补体系统,因此可用来评估RTX利用CDC机制清除CAR-T细胞的有效性和安全性。

图6. BRGS小鼠体内实验流程示意图

图6. BRGS小鼠体内实验流程示意图[3]

 

小鼠荧光成像实验结果显示(图7):

(1)在Mock组(不注射CAR-T细胞)小鼠体内,肿瘤细胞增殖不受抑制,加入RTX和加入IgG无明显区别。

(2)在CAR-T组(CAR里不含CD20)小鼠体内,肿瘤细胞增殖受到明显抑制,加入RTX和加入IgG无明显区别。

(3)在CubiCAR-T组小鼠体内,IgG对照组里的肿瘤细胞增殖受到明显抑制;而RTX组中肿瘤细胞增殖不受影响。

 

这些结果说明CubiCAR-T细胞与未经改造的CAR-T细胞一样,能有效抑制肿瘤细胞增殖;而且CubiCAR-T细胞能被RTX快速且特异性地清除。

图7. CubiCAR-T细胞在小鼠体内显示出抗肿瘤活性,并能被RTX特异性清除

图7. CubiCAR-T细胞在小鼠体内显示出抗肿瘤活性,并能被RTX特异性清除[3]

 

BRGS小鼠接种携带荧光素酶和GFP标记的人多发性骨髓瘤细胞(MM.1S-Luc GFP)后,在第17天随机分组注射CubiCAR-T、CAR-T或T细胞(mock-transduced T cells),并加入或不加入RTX进行处理,在第21天、第26天和第31天进行荧光成像分析。

 

总结

CAR-T细胞免疫疗法在肿瘤治疗方面具有广阔的前景,但同时也面临着包括严重药物副作用在内的一系列挑战。很多研究者们设计了各种能按需清除CAR-T细胞的“安全开关”,但它们都或多或少存在一些缺点,例如:药物体积过大、潜在的免疫原性、依赖未经批准的小分子作为活化剂等。除此以外,他们还有一个重要的共同点:这些“安全开关”都存在于与CAR分离的细胞表面,而这种设计可能会使CAR和安全开关的比例(CAR/safeguard)不平衡,导致不携带“安全开关”的CAR-T细胞的出现。而CubiCAR-T的设计将其“安全开关”CD20融于CAR中,并使用已获得FDA批准的抗体药物RTX,通过CDC机制对CubiCAR-T细胞进行按需清除,在保证药物有效性的同时,提高了药物安全性。此外,CubiCAR-T细胞将CD34表位融入CAR中,也能有效提高企业生产过程中对CAR-T细胞的检测和纯化效率。特别地,研究者们还尝试了将CubiCAR中靶向BCMA的ScFV替换为靶向CD123、CD22和CD19的ScFVs,这些CubiCAR-T细胞在体外实验中也都展现出了抗肿瘤活性,并能被RTX特异性清除。这些数据表明CubiCAR有望成为一种可应用于不同肿瘤类型的“通用型安全开关”。

 

References:

[1]Tegla CA., et al. Membrane attack by complement: the assembly and biology of terminal complement complexes[J]. Immunologic Research 51(1):45-60 (2011).

[2]Kenar D. Jhaveri and Mitchell H. Rosner. Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy and the Kidney. Clinical Journal of the American Society of Nephrology 13(5)796-798(2018).

[3]Valton J., et al. A Versatile Safeguard for Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapies. Scientific Reports 8:8972(2018).

[4]Rubenstein JL., et al. Multicenter phase 1 trial of intraventricular immunochemotherapy in recurrent CNS lymphoma. Blood 121:745–51(2013).

 

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