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BRGSF重度免疫缺陷小鼠的应用之构建人免疫系统(HIS)重建小鼠进行抗体研发

BRGSF重度免疫缺陷小鼠的应用之构建人免疫系统(HIS)重建小鼠进行抗体研发

 

BRGSF小鼠背景回顾

BRGSF(BALB/c Rag2tm1Fwa Il2rgtm1Cgn SirpaNOD Flk2tm1lrl)小鼠是目前市面上免疫缺陷程度最高的小鼠之一:Rag2Il2rg基因的敲除使BRGSF小鼠T、B、NK细胞缺失;SirpaNOD抑制了小鼠巨噬细胞对人源细胞的吞噬作用;Flk2基因的敲除使小鼠髓系细胞组分(特别是树突状细胞,DC)大幅减少(图1)。通过在BRGSF小鼠身上进行CD34+人造血干细胞(hematopoirtic stem cell,HSC)移植,我们可以得到人免疫系统(human immune system, HIS)重建小鼠:BRGSF-HIS小鼠。

 

BRGSF-HIS小鼠的优势之一是其具有所有主要的人造血干细胞分化亚群:包括人源淋系细胞 (e.g., T、B、NK细胞)、人源髓系细胞组分(e.g., 传统的树突状细胞(cDCs)、浆细胞样树突状细胞(pDCs)、单核/巨噬细胞)。

 

因此,BRGSF-HIS小鼠可用于靶向人pDCs的抗体研发。

图1. BRGSF重度免疫缺陷小鼠

图1. BRGSF重度免疫缺陷小鼠。

 

浆细胞样树突状细胞

树突状细胞(dendritic cells,DCs)是专职的抗原呈递细胞(antigen-presenting cell,APC),也是连接固有免疫(innate immunity)和适应性免疫(adaptive immunity)的桥梁。根据功能和来源,DCs可被分为:经典树突状细胞(conventional dendritic cells,cDCs)、浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cells,pDCs)、单核细胞来源的树突状细胞(monocyte-derived dendritic cells,MoDCs)和郎格罕细胞(Langerhans cells,LCs)[1]

 

特别地,其中的pDC亚群有着与浆细胞相似的形态。它主要存在于外周淋巴器官和血液循环中,能通过Toll 样受体(Toll-like receptor,TLR):TLR-7和TLR-9来识别核酸。被激活后,pDCs能产生大量以IFN-α和IFN-β为主的Ⅰ型干扰素(interferon,IFN),因此也被称为天然干扰素产生细胞(natural interferon–producing cells)[2]。此外,pDCs也能分泌包括IL-6和TNF在内的多种促炎细胞因子和趋化因子,它们与Ⅰ型干扰素一起,对T、B和NK等免疫细胞的功能进行调控。另外,值得一提的是, pDC的发育依赖于Fms样酪氨酸激酶3-配体(Fms-related tyrosine kinase 3-ligand,Flt3-L),而我们的BRGSF重度免疫缺陷小鼠敲除了Flk2(也称Flt3)基因,阻断了这条信号通路,造成包括pDCs在内的髓系组分(特别是DC)发育受损,数量大幅减少。而这降低了HIS后人源髓系细胞与相应的小鼠髓系细胞间的竞争,因此,人源髓系细胞在BRGSF-HIS小鼠体内发育得更好。

图2. DC亚群以及相关谱系

图2. DC亚群以及相关谱系[1]

 

pDCs参与了多种肿瘤的发生和进展。pDCs可以发生致瘤性转化(neoplastic transformation),产生母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤(Blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm, BPDCN);乳腺癌和卵巢癌中的浸润性pDCs与不良预后相关;骨髓微环境中的pDCs能促进多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)中肿瘤细胞的生长、存活,以及抗药性[3]pDCs也与自身免疫疾病有关。尽管机体有很多机制来避免pDCs对自身物质的识别,但仍有漏网之鱼的出现。pDCs针对这些自身抗原释放大量IFNs,引发自身免疫疾病。

 

人pDCs表面高表达达CD123、CD303和CD304等分子,而小鼠pDC的表面标记则是CD11cintCD11bB220+SiglecH+CD317+[4]特别地,CD303是人pDCs的特异性标记物,也称血液树突状细胞抗原2(blood dendritic cell antigen 2,BDCA-2)。因此,靶向CD303的抗体有望用于治疗有浸润性pDCs参与的癌症、自身免疫性疾病以及炎性疾病。

 

Case study:构建BRGSF-HIS小鼠进行靶向人pDCs的抗体研发

2018年,Dr. Fournier等人经过一系列选择与优化,构建了一种靶向人CD303的嵌合单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)-- ch122A2[5]

 

体外实验显示,Ch122A2 mAb能下调人pDCs的IFN-α分泌量(图3)。而且剂量为1ng/ml时,使用效果比Biogen公司研发的同样靶向CD303的人源化IgG1单克隆抗体(BIIB059/24F4)更好。

图3. Ch122A2 mAb能下调人pDCs经CpG刺激后的IFN-α分泌量

图3. Ch122A2 mAb能下调人pDCs经CpG刺激后的IFN-α分泌量。将5×104 个人pDCs和1 mM CpG 以及不同浓度的IgG1、24F4或ch122A2共培养。

 

由于CD303只在pDCs上特异性表达,因此研究人员们选用了BRGSF-HIS小鼠进行体内实验。因为BRGSF-HIS小鼠支持人源多谱系造血重建,重建后,小鼠体内不仅具有人源淋系组分,还具有包括pDCs等在内的多种人源髓系细胞组分。

 

体内实验显示(图4):

(1)ch122A2 mAb在BRGSF-HIS小鼠的外周血中具有快速而强烈的人pDC耗竭能力,且这个效果能维持至少3天。

(2)ch122A2 mAb在BRGSF-HIS小鼠的脾脏中对人pDC耗竭能力中等,但与IgG1 mAb对照组依然有显著性差异。

(3)h122A2 mAb在BRGSF-HIS小鼠的骨髓中对人pDC没有明显耗竭能力。

 

这些实验结果显示ch122A2 mAb可以通过耗竭pDCs以及下调Ⅰ型干扰素等促炎细胞因子的分泌,从而达到改善患者症状的目的,是一种十分有应用前景的特异性靶向人pDCs的抗体药物。

图4. ch122A2 mAb在BRGSF-HIS小鼠的外周血(A)、脾脏(B)和骨髓(C)中的pDC耗竭能力

图4. ch122A2 mAb在BRGSF-HIS小鼠的外周血(A)、脾脏(B)和骨髓(C)中的pDC耗竭能力。

 

总结

pDCs是机体内Ⅰ型干扰素的主要产生细胞,越来越多的研究显示它与自身免疫性疾病与炎性疾病相关,例如皮肤红斑狼疮(cutaneous lupus erythemtosus,CLE)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)、干燥综合征(Sjogren syndrome)等。目前,这些疾病都没有特效药物可以治疗。前文提到的靶向pDCs表面特异性标记物CD303的BIIB059/24F4抗体目前正处于临床试验阶段,适应症为CLE和SLE。Biogen公布的临床2期试验结果显示,与安慰剂相比,BIIB059/24F4抗体能显著改善患者症状,而两者的严重副作用发生频率相近。这些数据都表明pDCs在机体免疫应反应中起到了重要的作用。

 

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基因编辑大小鼠肿瘤模型

传统免疫缺陷小鼠(BALB/c nude、NOD scid)

重度免疫缺陷小鼠(BRGSF、C-NKG)

人免疫系统重建小鼠(BRGSF-HIS)

同源肿瘤移植模型(Syngenic)

人源肿瘤细胞系异种移植(CDX)模型

单免疫检查点人源化小鼠(hPD-1、hCTLA-4、 hGITR、 hVISTA......)

双免疫检查点人源化小鼠(hPD-1 & hVISTA、 hPD-1 & hCTLA-4、 hCTLA-4 & hLAG3)

 

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参考文献:

[1] Eisenbarth, S. C. (2019). Dendritic cell subsets in T cell programming: location dictates function. Nature Reviews Immunology, 19:89–103.

[2] Colonna, M., Trinchieri, G., & Liu, Y.J. (2005). Plasmacytoid dendritic cells in immunity. Nature Immunology, 5(12), 1219-1226.

[3] Chauhan D., Singh A.V., Brahmandam M., et al. (2009). Functional interaction of plasmacytoid dendritic cells with multiple myeloma cells: a therapeutic target. Cancer Cell, 16:309–23(2009).

[4] Patente, T.A., et al. (2019). Human Dendritic Cells: Their Heterogeneity and Clinical Application Potential in Cancer Immunotherapy. Front. Immunol.

[5] Fournier, N., et al. (2018). Improved in vitro and in vivo activity against CD303-expressing targets of the chimeric 122A2 antibody selected for specific glycosylation pattern. mAbs, 10:4, 651-663.

 

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