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免疫系统人源化小鼠的分类及其在抗HIV细胞免疫疗法中的应用

免疫系统人源化小鼠的分类及其在抗HIV细胞免疫疗法中的应用

 

BRGSF小鼠背景回顾

BRGSF(BALB/c Rag2tm1Fwa Il2rgtm1Cgn SirpαNOD Flk2tm1lrl)小鼠是目前市面上免疫缺陷程度最高的小鼠之一:Rag2Il2rg基因的敲除使BRGSF小鼠T、B、NK细胞缺失;SirpαNOD抑制了小鼠巨噬细胞对人源细胞的吞噬作用;Flk2基因的敲除使小鼠髓系细胞组分(特别是树突状细胞,DC)大幅减少(图1)。这种免疫系统上的高度缺陷使BRGSF小鼠对各类人源移植物高度兼容,同时也是构建免疫系统人源化小鼠的优秀模型。

 

因此,通过在BRGSF小鼠身上进行人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)移植,我们可以得到以人源T细胞重建为主的PBMC免疫系统人源化小鼠。这种小鼠可用于需要成熟T细胞的短期研究,例如HIV/AIDS相关研究。

图1. BRGSF重度免疫缺陷小鼠

图1. BRGSF重度免疫缺陷小鼠。

 

免疫系统人源化小鼠

人源化小鼠是指携带功能性人类基因、细胞、组织、器官或免疫系统,甚至是微生物的小鼠,可用于生物医学研究和临床治疗方案的开发。其中,免疫系统人源化小鼠,也称为人免疫系统重建小鼠,是指通过将人的造血干细胞、免疫细胞或组织移植到免疫缺陷小鼠体内,使其能重建人类免疫系统的小鼠模型。这类小鼠可以更有效地模拟人体免疫系统的反应,为人类肿瘤免疫、自身免疫性疾病,以及人特异性传染疾病(例如由人类免疫缺陷病毒HIV引起的获得性免疫缺陷综合征AIDS)的转化研究提供优秀模型。

 

不同类型免疫系统人源化小鼠的对比

根据重建方法,免疫系统人源化小鼠可大致被分为以下三类。

1 Hu-PBL小鼠,也称为Hu-PBMC小鼠

构建方法:经尾静脉(i.v.)、腹腔(i.p.)或脾内(intrasplenic)注射人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)到成年免疫缺陷小鼠体内。

 

人源免疫系统重建时间:约2周。

 

优点:

①操作简单,成本低;

②T细胞移植效率高。

 

缺点:

①重建以人源T细胞为主,B细胞和髓系细胞数量较低(可能是因为缺乏与它们生存相关的人源细胞因子);

②产生致死性GvHD(一般在移植后4~6周),实验窗口期短;

③供体来源不稳定,结果差异较大(可使用多个供体进行实验,以确保疗效是药物特异性,而不是供体特异性的)。

 

应用:需要成熟T细胞的短期研究、GvHD方面的研究,例如HIV/AIDS等。

 

备注:

①PBMC通常由Ficoll-Hypaque密度梯度离心法获得,这种方法能去除大部分的中性粒细胞;

②GvHD: Graft vs. Host Disease,移植物抗宿主病。产生GvHD的小鼠会出现体重明显下降、弓背、脱毛、腹泻、脱皮等现象;

③可通过敲除免疫缺陷小鼠的MHC-I/II基因,或降低PBMC中CD4+T细胞的比例(可能会降低小鼠适用性),来延缓GvHD的出现。

 

2 Hu-HSC小鼠,也称为Hu-CD34小鼠

构建方法:将来源于脐带血、胎肝、骨髓,或动员后外周血的人CD34+造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)通过尾静脉、腹腔或骨髓腔,注射到经亚致死剂量辐照(或经化学药物白消安Busulfan处理)进行清髓以后的成年免疫缺陷小鼠体内;或者肝内(intrahepatic)注射HSC到新生免疫缺陷小鼠体内。

 

人源免疫系统重建时间:约12周。

 

优点:

①多谱系人免疫细胞分化,包括淋系的T、B、NK细胞,小部分重度免疫缺陷小鼠也支持人源髓系细胞分化(详见BRGSF-HIS小鼠,点此查看);

②无/弱GvHD,实验窗口期长。

 

缺点:

①缺乏供人源T细胞发育成熟的人胸腺,T淋巴细胞数量较少;

②需要对小鼠进行清髓处理;

③供体差异性。

 

应用:免疫肿瘤学、传染病学的长期研究,例如免疫细胞发育分化、过继性T细胞疗法(adoptive T cell transfer)、HIV/AIDS等。

 

备注:

①HSC的来源、注射方式、小鼠的年龄、性别和品系等因素都会影响重建效率;

②通过辐照和Busulfan处理破坏小鼠自身HSC,从而促进人HSC的植入效率;

③人造血系统及免疫细胞是由人HSC在免疫缺陷小鼠体内发育而来,对宿主免疫耐受,通常不会发生GvHD。

 

3 Hu-BLT小鼠

构建方法:免疫缺陷小鼠经亚致死剂量辐照以后,将人胎肝和胎胸腺移植到小鼠的肾包膜下,同时尾静脉注射同一供体的胎肝或骨髓来源的HSC。

 

人源免疫系统重建时间:约16周。

 

优点:

①人源免疫系统重建最完善的模型;

②具有HLA(human lymphocyte antigen ,人类淋巴细胞抗原)限制性人源T细胞(T细胞可以在人胸腺上皮内发育成熟)。

 

缺点:

①人体组织取自流产胎儿,来源受限,且面临极大的伦理争议;

②操作复杂,且需要对小鼠进行清髓处理;

③产生GvHD(一般在移植后20周后)。

 

应用:免疫肿瘤学、传染病学的研究,例如HIV/AIDS、细胞因子释放综合征(cytokine-release syndrome,CRS)、免疫检查点抑制剂副作用等。

 

备注:

①BLT = Bone marrow,Liver,Thymus。

②人源T细胞可以在人胸腺上皮内经历阳性选择(positive selection),但这种阳性选择仅针对人源细胞,与鼠源MHC有亲和力的人源T细胞并不会被清除,因此,Hu-BLT小鼠中的GvHD发生率比在Hu-HSC小鼠中的要高。

图2. 三种免疫系统人源化小鼠的构建方式

图2. 三种免疫系统人源化小鼠的构建方式。[5]

 

Case study:构建Hu-PBMC BRGS免疫系统人源化小鼠进行抗HIV细胞免疫疗法研究

CD4+ T细胞是适应性免疫中的一种重要免疫细胞,它能识别抗原呈递细胞上MHC II类分子呈递的抗原肽,并启动免疫应答。同时,CD4+ T细胞也是人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)的主要宿主细胞,HIV的攻击会导致其细胞数目和功能的下降。

 

有研究表明 HIV-1 X4病毒株在初始CD4+ T细胞和人SupT1(T淋巴母细胞瘤细胞)都存在的情况下,会优先攻击SupT1细胞[6]。为了验证了这个结论,意大利科学家Jonathan Fior首先进行了体外实验[7]。为了模拟HIV血清阳性患者的情况,他将SupT1细胞与人PBMC共培养,并加入HIV-1 LAI病毒株进行感染处理(实验组),或不进行感染处理(对照组)。体外实验结果显示,SupT1细胞可以显著延缓HIV对PBMC中初始CD4+ T细胞的杀伤作用,HIV优先攻击SupT1细胞。此外,HIV病毒在SupT1细胞中持续复制后,细胞病变效应降低,对抗体介导的中和反应变得更敏感。

 

为了进一步在体内验证这个结果,Dr. Fior将人PBMC注射到BRGSF小鼠的前身——BRGS(BALB/c Rag2tm1Fwa IL-2Rγctm1Cgn SIRPαNOD)小鼠体内,构建Hu-PBMC BRGS免疫系统人源化小鼠[8]。BRGS小鼠与其“升级版”BRGSF小鼠一样,缺乏T、B、NK细胞,巨噬细胞对人源细胞吞噬作用弱,可用于构建免疫系统人源化小鼠。在用HIV-1 LAI病毒株感染Hu-PBMC BRGS小鼠后,每周向小鼠体内输入4×107经30Gy辐照后的SupT1细胞,持续四周(辐照能有效避免SupT1细胞在小鼠体内增殖,降低致瘤性)。结果显示,在接种SupT1细胞的第一周,加入了SupT1细胞(PBMC+SupT1+HIV)的小鼠外周血的病毒载量比对照组(PBMC+HIV)少10倍以上,组间差异显著(图3);而且CD4+ T细胞数目也更多(图4)。这些实验数据表明体内接种经辐照过的SupT1细胞可能是一个有效的抗HIV-1的细胞免疫疗法。

图3. Hu-PBMC BRGS小鼠外周血中的HIV-1病毒载量

图3. Hu-PBMC BRGS小鼠外周血中的HIV-1病毒载量[8]

病毒载量为每毫升血浆中病毒的拷贝数,数值以log形式展现。图中展示了单个小鼠的数据(空心圆)和每组平均数据(虚线)。红色虚线表明实验检测阈值,低于阈值的数值不参与统计分析。*p<0.05(t-test统计分析)。

 

图4. Hu-PBMC BRGS小鼠外周血T细胞中CD4+CD8-和CD4+CD8+ T细胞的含量

图4. Hu-PBMC BRGS小鼠外周血T细胞中CD4+CD8-和CD4+CD8+ T细胞的含量

图4. Hu-PBMC BRGS小鼠外周血T细胞中CD4+CD8-和CD4+CD8+ T细胞的含量[8]

图中展示了单个小鼠的数据(空心圆)和每组平均数据(虚线)。*p<0.05(t-test统计分析)。

 

总结

人源化小鼠是进行临床前药物研究的优秀工具。其中,在免疫缺陷小鼠体内进行人PBMC、HSC或胎肝、胎胸腺移植而得到的免疫系统人源化小鼠可进一步模拟人体的免疫反应,评估免疫疗法的有效性和安全性,为转化研究提供了可靠的选择。目前,这些免疫系统人源化小鼠模型已在多个研究领域得到了使用,包括HIV/AIDS、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、CAR-T细胞免疫疗法、NK细胞免疫疗法、免疫检查点抑制剂等。但与此同时,这些模型也存在着一些亟需优化的地方,例如,人源免疫细胞的植入效率、GvHD的产生、人源髓系细胞的发育等。深入了解这些模型的优缺点将有助于我们选择更合适的模型进行研究,提高临床转化率。

 

赛业生物重度免疫缺陷鼠BRGSF及药效评价服务

BRGSF小鼠是目前市面上免疫缺陷程度最高的小鼠之一,对各种来源的CDX和PDX高度兼容,可用于实体瘤和血液瘤研究。与N*G小鼠不同,BRGSF小鼠为BALB/c背景,其体内拥有完整的补体级联反应,也可用于研究补体依赖的细胞毒性(CDC)机制。BRGSF小鼠经人CD34+造血干细胞移植重建可得到BRGSF-HIS小鼠,具有所有主要的人造血干细胞分化亚群,人源髓系细胞分化完全,人源细胞长效存在,实验窗口期长,且无贫血现象。赛业生物可以根据您的需求提供BRGSF小鼠及相关的药效评价服务。

 

此外,赛业生物还可以提供各种有效的肿瘤模型,如传统免疫缺陷鼠BALB/c nude(裸鼠)和NOD scid、重度免疫缺陷鼠C-NKG、免疫检查点人源化小鼠、肿瘤细胞系移植模型、人源肿瘤组织异种移植模型(CDX)、基因修饰模型及表型分析服务等。我们可以构建各类皮下、原位或者转移瘤模型,并针对相应的模型提供高度定制化的体内药效学服务,以满足您的需求。

 

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参考文献:

[1] Skelton J.K., Ortega-Prieto A.M., and Dorner M.A. Hitchhiker's Guide to Humanized Mice: new pathways to studying viral infections. Immunology (2018).

[2] 郭文文, 乔天运, 张彩勤等. 免疫系统人源化小鼠模型的构建及其在肿瘤治疗研究中的应用. 中国比较医学杂志. 29(11): 98-104 (2019).

[3] Allen T.M., Brehm M.A., Bridges S., et al. Humanized immune system mouse models: progress, challenges and opportunities. Nat Immunol. 20, 770–774 (2019).

[4] Rochere P.D.L., Guil-Luna S., Decaudin D., et al. Humanized Mice for the Study of Immuno-Oncology. Trends Immunol. 39(9):748-763 (2018).

[5] Rochere P.D.L., Guil-Luna S., Decaudin D., et al. Humanized Mice for the Study of Immuno-Oncology. Trends Immunol. 39(9):748-763 (2018).

[6] Das A.T., Land A., Braakman I., et al. HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro. Virology. 263:55–69 (1999).

[7] Fior J. An initial in vitro investigation into the potential therapeutic use of SupT1 cells to prevent AIDS in HIV-seropositive individuals. PLoS One. 7(5):e37511 (2012).

[8] Fior J. SupT1 Cell Infusion as a Possible Cell-Based Therapy for HIV: Results from a Pilot Study in Hu-PBMC BRGS Mice. Vaccines (Basel). 26;4(2):13 (2016).

 

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