看看这篇文献是如何设计内质网应激信号通路实验思路的

内质网对各种应激刺激具有独特的感知和反应能力。内质网应激反应可由过量或错误折叠的蛋白质积累、葡萄糖缺乏等细胞功能失衡引起。其通过三种主要机制来恢复体内平衡，统称为未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）^[1]。肌醇需求酶1α（IRE1α）介导的X盒结合蛋白1（XBP1）可变剪接是内质网UPR的主要效应通路之一，功能上也最为保守^[2]。IRE1是一种内质网驻留跨膜核酸内切酶/激酶，其位于内质网腔的氨基末端区负责感受各种内质网应激刺激。受到刺激后，IRE1α二聚化并发生构象改变，自身磷酸化并激活核酸内切酶活性^[3]。

XBP1 mRNA是哺乳动物IRE1目前已知唯一的酶切底物。正常情况下，XBP1 mRNA可翻译产生一个261个氨基酸的非剪接型蛋白（XBP1 unsplicing isoform, XBP1u）。其具有一个N末端二聚体结构域、内部的碱性亮氨酸拉链结构域（bZIP）以及含有两个疏水区、核输出信号和蛋白酶体结合位点的C末端^[4]。受到刺激后，XBP1u的翻译暂停，新转录的XBP1u mRNA在细胞质Sec61转运子辅助下，借助其HR2结构域与内质网结合。在激活的IRE1α和连接酶RtcB作用下，其中的26个核苷酸被去除，产生开放阅读框移位，最终产生一个376氨基酸的剪接后蛋白（XBP1 splicing isoform, XBP1s）^[4]。XBP1s保留了N末端的二聚体结构域和内部bZIP结构域，C端出现反式激活结构域，形成一个完整的转录因子，负责应激反应后的转录调控。

图1. XBP1非常规剪接示意图

氧化应激损伤是多种心血管疾病发病的使动因素，如冠状动脉粥样硬化性心脏病、心肌缺血再灌注损伤、高血压性心脏病，亦属于内质网应激反应的一种。前期研究表明XBP1可变剪接参与了多种血管生理和病理过程，比如血管内皮细胞生长因子（VEGF）介导内皮细胞增殖（血管新生）^[5]、血小板源生长因子（PDGF）介导平滑肌细胞增殖（新生内膜形成）^[6]、紊流刺激下的内皮细胞凋亡（动脉粥样硬化）^[7]等。感兴趣的小伙伴可查看以上相关研究论文进行学习。本期我们介绍今年3月份发表于J Biol. Chem.的一篇论文^[8]。作者在探究血管损伤后新生内膜形成的机制中发现了一种由血管平滑肌细胞表达的Ⅳ型胶原新异构体（COL4A1s）。该蛋白通过旁分泌机制招募驻留于外膜的血管祖细胞，促进其迁移并最终促进损伤处的新生内膜形成。下面让我们解读一下文章的几张重要Figure，探讨XBP1条件敲除小鼠在整个实验设计中的作用。

XBP1在胚胎发育和血管重塑过程中对COL4A1的表达至关重要

该课题组以往的研究表明XBP1的剪接参与了血管损伤后血管平滑肌细胞发生增殖表型转化（PMID: 26315405）；来自过表达XBP1s的血管平滑肌细胞，其培养液上清能促进小鼠血管祖细胞（VPC）迁移（原文Figure 6）。为验证XBP1、COL4A1和血管祖细胞迁移之间是否存在相关性，作者检测了血管平滑肌细胞条件敲除XBP1小鼠中COL4A1的表达和血管祖细胞迁移。结果表明导丝损伤血管内膜后，野生型小鼠组α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）和干细胞抗原1阳性（Sca1⁺）细胞被招募到新生内膜区域。而血管平滑肌细胞条件敲除XBP1后上述细胞的募集和内膜生成受到显著抑制。值得注意的是，血管平滑肌细胞XBP1的敲除还显著降低了血管壁COL4A1的表达水平。由于XBP1全敲小鼠具有胚胎致死性，研究人员对Xbp1^+/- X Xbp1^+/-胚胎中COL4A1表达水平进行了检测，发现Xbp1基因缺失导致COL4A1以基因依赖的方式降低表达。

图2. XBP1s对COL4A1在胚胎发育和血管重塑过程中的表达至关重要

过表达XBP1s诱导COL4A1新型异构体的表达

COL4A1和COL4A2共用一段启动子。RT-PCR表明过表达XBP1s可上调COL4A1和COL4A2 mRNA水平。过表达XBP1s后，在血管平滑肌细胞培养上清中检测到分子量更小（50kDa条带）的COL4A1条带，提示COL4A1可能发生了降解。酶谱分析表明过表达XBP1s确实增加了一些蛋白酶的分泌。但酶抑制剂并不能消除XBP1s诱导出的50kDa COL4A1条带，提示其并非蛋白酶降解而来。

图3. XBP1剪接异构体（XBP1s）诱导出一种新的COL4A1s异构体

有文献报道COL4A1的非胶原（non-collagen, NC）结构域可被蛋白酶降解，并影响血管祖细胞的迁移，但NC结构域分子量通常小于40kDa。该50kDa蛋白条带很可能为COL4A1的一种新异构体。为验证这一点，作者设计了一对全长引物行常规RT-PCR，并扩增出一条1.6kb条带（预期为5kb）。克隆测序结果表明该PCR产物为一种新的转录变体，其第4外显子的后部和第42外显子的前部间发生拼接，开放阅读框保持不变。这种新转录变体可翻译553个氨基酸的蛋白并外泌，故命名为COL4A1s（soluble COL4A1s），其中信号肽、7S结构域和NC结构域均得以保留，而内部螺旋结构域长度大大缩短。随后，作者进一步提出了COL4A1s发生的两种可能机制，即mRNA水平的非常规剪接和基因水平的绕行转录，并通过体外转录、ChIP、DNA-蛋白拉下实验等进行了验证，感兴趣的小伙伴可以查阅原文的Figure 5。

图4. XBP1s诱导表达一种可外泌COL4A1s新异构体

小结

在这项研究中，明确血管平滑肌细胞XBP1s对COL4A1s的上游调控作用是后续开展机制研究的先决条件。为此作者构建了血管平滑肌细胞条件敲除XBP1的转基因小鼠，并在此基础上构建了股动脉导丝拉伤模型，通过免疫组化、免疫荧光等实验技术阐释了血管损伤对XBP1s、COL4A1及血管壁细胞组成的直观认识。考虑到XBP1全敲小鼠存在胚胎致死的特点，研究者将XBP1^+/-小鼠交配产生的不同基因型胚胎作为另一种验证方式。最终，从在体水平证实了XBP1为COL4A1上游调控基因的研究线索，为后续深入开展XBP1s-COL4A1s信号通路调控血管损伤后新生内膜形成的机制研究奠定了基础。

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原文检索：

1. Ren J, Bi Y, Sowers JR, Hetz C, Zhang Y. Endoplasmic reticulum stress and unfolded protein response in cardiovascular diseases. Nature reviews Cardiology. 2021.

2. Sriburi R, Jackowski S, Mori K, Brewer JW. XBP1: a link between the unfolded protein response, lipid biosynthesis, and biogenesis of the endoplasmic reticulum. The Journal of cell biology. 2004;167(1):35-41.

3. Ali MM, Bagratuni T, Davenport EL, Nowak PR, Silva-Santisteban MC, Hardcastle A, et al. Structure of the Ire1 autophosphorylation complex and implications for the unfolded protein response. The EMBO journal. 2011;30(5):894-905.

4. Yanagitani K, Kimata Y, Kadokura H, Kohno K. Translational pausing ensures membrane targeting and cytoplasmic splicing of XBP1u mRNA. Science (New York, NY). 2011;331(6017):586-589.

5. Zeng L, Xiao Q, Chen M, Margariti A, Martin D, Ivetic A, et al. Vascular endothelial cell growth-activated XBP1 splicing in endothelial cells is crucial for angiogenesis. Circulation. 2013;127(16):1712-1722.

6. Zeng L, Li Y, Yang J, Wang G, Margariti A, Xiao Q, et al. XBP 1-Deficiency Abrogates Neointimal Lesion of Injured Vessels Via Cross Talk With the PDGF Signaling. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 2015;35(10):2134-2144.

7. Zeng L, Zampetaki A, Margariti A, Pepe AE, Alam S, Martin D, et al. Sustained activation of XBP1 splicing leads to endothelial apoptosis and atherosclerosis development in response to disturbed flow. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2009;106(20):8326-8331.

8. Angbohang A, Huang L, Li Y, Zhao Y, Gong Y, Fu Y, et al. X-box binding protein 1-mediated COL4A1s secretion regulates communication between vascular smooth muscle and stem/progenitor cells. The Journal of biological chemistry. 2021:100541.

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