【每周一鼠】无菌小鼠模型在微生物组学中的应用

疾病动物模型是研究人类疾病发生发展机制、药物筛选及疗效评价必不可少的工具，好的疾病动物模型可以加快新药的研发速度。你还在为不知道选择什么小鼠模型发愁吗？你还在为造模发愁吗？赛业生物新栏目《每周一鼠》，每周更新，为大家讲解一个疾病小鼠模型的故事，希望对大家了解不同的疾病小鼠模型有所帮助。今天和大家见面的是无菌鼠。

随着基因组学、代谢组学等高通量检测技术的应用，人们逐渐认识到胃肠道微生物群存在巨大遗传多样性和代谢复杂性。这些共生细菌通过与宿主的复杂交互作用调节胃肠道的发育和功能，与营养代谢、肿瘤、免疫、衰老等多种生理或病理状态密切相关。在人体微生物组学中，96-99%的微生物聚集在胃肠道，同时也是研究领域的重点方向，并且从2011年开始，微生物研究成果屡上十大科学突破榜。但由于体内微生物群体组成和作用的网络十分复杂，且每一个自然个体体内的微生物组成都不完全相同，使得其研究十分困难。因此需要一种理想的模型来探索微生物与宿主的作用及相关机制，而无菌动物就是理想的模型。

无菌动物的发展史

1885年，路易斯·巴斯德即提出生命依赖于微生物的定殖，并尝试研究宿主与微生物的相互作用。为测试动物宿主能否在无菌（germfree, GF）状态下生存，Nuttal和Thierfelder首次在无菌条件下饲养豚鼠。这种无菌豚鼠外观健康，并于第8天处死，其肠内容物没有检出细菌。同时此次试验也观察到了一些显著的表型差异，例如盲肠增大（常规体积的五倍）。其盲肠中充满了“一种含奶酪块样物质的棕色液体”。研究表明这些盲肠内容物中含有毒性生物活性物质，可导致平滑肌收缩能力的改变。这种无菌动物模型在生理和生化方面也表现出一定的异常表型，如免疫系统功能改变，轻度慢性腹泻，代谢紊乱，生殖能力降低等^[1]。

图1. 12周龄的无菌Swiss Webster雌鼠和常规饲养小鼠的腹腔脏器比较（*表示盲肠）

20世纪中期前，受技术限制，饲养健康的无菌动物一直是一项挑战。20世纪40年代中期至50年代初，Reyniers等创造了不锈钢制的无菌动物大型隔离器，使无菌动物的研究逐渐系统化。20世纪50年代末，研究人员已掌握无菌类动物模型的饲养技术，成功饲养无菌豚鼠、小鼠和鸡。此后研究人员开始将无菌动物与传统饲养的动物进行比较研究，通过一次引入一种或几种微生物菌种，探究宿主与微生物的相互作用^[2]。借助这些无菌动物模型，科学家们逐渐揭示了微生物-微生物相互作用、基因-微生物相互作用、饮食-微生物相互作用以及影响胃肠道微生物定殖的因素等。

无菌动物（小鼠）基本概念

无菌动物指现有检测方法不能检出任何活的微生物和寄生虫的动物。“无菌”不是绝对的，只是依据现有技术尚无法检出已知的微生物和寄生虫。即使是SPF级动物也难以排除自身携带潜在致病菌的可能，其体内存在特异性抗体等免疫激活状态，会对后续实验研究产生潜在干扰，甚至影响实验结果的判读。无菌动物必须是采用特殊技术保证动物从出生后即无菌，需要在隔离系统繁育饲养，即在无菌条件下经人工剖宫产获得子代动物，再放入无菌隔离系统内经人工喂乳或无菌母体动物代乳喂养。在饲养繁育过程中，使用的饲料、饮水需经过严格消毒，并通过定期检测手段确保动物体内外无一切微生物和寄生虫。

无菌小鼠是目前研究宿主-微生物相互作用的重要动物模型，主要原因有三。首先，实验小鼠的基因型已得到很好的表征。其次，小鼠和人类基因组在功能上99%相似度。第三，转基因小鼠不同于其他实验动物，它允许我们引入精确的基因修饰（如基因插入、敲除和修饰），允许我们在活体状态下研究修饰基因的功能。将转基因小鼠净化繁育为无菌模型后，可进一步了解环境和宿主基因对微生物群落的影响，以及微生物群落对宿主基因表达、表观遗传变化和宿主生理学的影响，作为构建微生物靶向疗法的临床前模型。

无菌动物的特征

无菌动物由于饲养方法特殊，其结构、功能与普通动物有很大区别，表现为：肠道肌层变薄、盲肠显著肥大、肠粘膜绒毛增多、肝重量下降；血液系统中白细胞增加且数值恒定；单核-吞噬细胞功能降低，脾缩小，无三级滤泡；淋巴组织发育不良，产生抗体的能力很弱，对微生物感染异常敏感；肠上皮细胞更新率低，肠壁物质交换较慢。

无菌饲育设施

无菌饲育设施在空间布局和人员安排方面需要专业基础设施，包括但不限于适当的声屏障、应急电源和中心警报、高效过滤器进气口和正压空间。在上述场地条件下，小鼠饲养于可调节的隔离装置中，其温度、湿度、压力、气流等因素能得到精确控制[3]。食物、水和其他用品必须用高压灭菌装置、辐照或消毒剂充分消毒，以灭活所有活微生物和寄生虫，饲料中还需补充肠道细菌合成的营养成分。随后将装载上述物品的高压灭菌桶经转移套筒送入隔离饲养室，转移套筒传送前须消毒灭菌。也可将其他方式灭菌的物品置于传递仓处，在送入隔离装置前进行消毒。类似方法也可用于隔离饲养室内物品和样本的取出。

图2. 无菌小鼠的食物（上）、垫料（中）和饮水（下）依次通过封装、贴消毒指示标签、进入消毒桶消毒后才可进入隔离室

根据不同使用目的，无菌小鼠可饲养在不同型号隔离器内。一般大型隔离器可用于种群繁育或实验组只数较多的实验用途，较小的隔离器（容纳4-5个笼子）中主要用于一般规模实验或重要品系保种。后者多数情况下可饲养一组的小鼠实验需求只数，相较前者，在有限空间内可开展更多的实验。场地内应配专业技术人员，负责饲养设施的日常工作、定期维护和小鼠的繁育管理或实验操作。

图3. 无菌鼠饲养设备。A）用于饲养无菌小鼠的隔离装置；B）灭菌桶

净化繁育

无菌动物在自然界中并不存在，只能依靠人工养育。一般将临产前的健康动物用麻醉药物或拉断颈椎处死后，立即浸泡于37℃灭菌液中浸泡，随后送进无菌室（或无菌隔离器），通过无菌手术剖腹取出无菌状态的带胎子宫。将子宫浸入消毒液后再立即输送至另一只隔离器中，切开子宫取胎。幼崽经灭菌纱布擦拭并断脐后放入隔离器内人工喂乳或由其他无菌雌鼠代养。

无菌状态的监测

为确保无菌动物的无菌状态，必须定期对小鼠生活标本和粪便标本进行监测。检测方法包括培养法、革兰氏染色和16srRNA检测。此外，可送检隔离包内活体小鼠进行监测。

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参考文献：

1. Mazmanian SK, Liu CH, Tzianabos AO, Kasper DL. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 2005;122(1):107-118.

2. Williams SC. Gnotobiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2014;111(5):1661.

3. Arvidsson C, Hallén A, Bäckhed F. Generating and Analyzing Germ-Free Mice. Current protocols in mouse biology. 2012;2(4):307-316.

4. Fontaine CA, Skorupski AM, Vowles CJ, Anderson NE, Poe SA, Eaton KA. How free of germs is germ-free? Detection of bacterial contamination in a germ free mouse unit. Gut Microbes. 2015;6(4):225-233.

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