想了解细胞产品及试剂相关内容,请点击这里进入OriCell网站
  • 高脂造模Apoe KO小鼠,仅需980元/只,下单即送精美礼品
  • C-NKG小鼠可享买三送一

基因敲除,用质粒、病毒、还是……?

基因敲除,用质粒、病毒、还是……?

 

众所周知,CRISPR-Cas作为一项基因编辑技术,目前已经是生命科学领域家喻户晓的技术了。但虽说这项技术非常火爆,仍有许多同学对基因编辑技术存在理解偏差,比如最常见的,在应用CRISPR-Cas构建基因敲除(KO)细胞系,到底采用质粒法、病毒法还是有其他更好的方法呢?

 

说到这个问题,就不得不提当初CRISPR-Cas技术刚兴起时,所展现的切割效率和敲除成功率极大的吸引了科研界的关注,但是科研人员进行相关实验时经常会遇到:“一学就会,一做就废”的问题。他们发现,完全按照文献的方法进行基因敲除,成功率并没有想象的高,且还存在对细胞转染效率低的问题。因此有一些课题组就尝试通过慢病毒转染的方式进行敲除,提高转染效率的同时,将Cas蛋白基因整合到基因组中,通过提高增加Cas蛋白和sgRNA的作用时间来提高细胞敲除效率。

 

★ 慢病毒法 ★

但是,慢病毒感染存在着两个比较关键的问题:

1. 利用慢病毒法转染Cas会在敲除靶基因的同时引入新的基因,而且慢病毒转染的外源基因是随机整合,存在影响其他基因表达的风险。

2. CRISPR-Cas编辑过程存在脱靶效应,慢病毒法会持续表达Cas蛋白,长期存在的Cas蛋白会对这种脱靶效应有累积效应,最终影响实验的严谨性。

图1. 慢病毒感染进行基因敲除

图1. 慢病毒感染进行基因敲除

 

★ 质粒法 ★

为了降低这种脱靶效应,采用的策略是减少Cas蛋白与sgRNA复合物在细胞中的存留时间,因此我们还可以采用质粒法进行KO细胞的构建。即通过将Cas和sgRNA表达载体瞬时转染到目的细胞中,从而在细胞内表达Cas蛋白和gRNA,由于质粒整合到基因组的概率极低,随着细胞传代质粒载体的逐渐消失,再经过PCR验证和测序筛选出纯合的敲除细胞。但质粒法也存在一个较大的问题,即感染效率较低。

 

★ RNP法 ★

与质粒法不同的是,RNP法是通过电刺激转染的方法直接将Cas蛋白和sgRNA复合物转染到细胞中。由于Cas蛋白是不带电荷的,而sgRNA是带电荷的,因此只有当Cas与sgRNA结合后,才能更高效的将两者转染到细胞中。同时,由于Cas和sgRNA会被降解,Cas-sgRNA复合物在细胞内的存留时间不会很长,因此发生脱靶的概率很低,但相应的切割效率也可能有一定降低。

图2. Cas蛋白与gRNA形成RNP复合物

图2. Cas蛋白与gRNA形成RNP复合物

 

从国内外文献报道的情况来看,质粒法和RNP法是目前主流的基因敲除策略,对于课题组实验室而言,质粒法可能更容易实施,而对于生物技术企业,RNP法则具有更高的实验效率。但这两种不同的方法只是殊途同归,只要能达到敲除效果的就是好方法。

 

★ 赛业生物Smart-CRISPR™基因编辑系统 ★

赛业生物独创Smart-CRISPR™技术,是基于人工智能的AlphaKnockout基因编辑专家系统和CRISPR-Cas技术自主开发的细胞基因编辑系统,相比普通CRISPR-Cas技术的基因切割效率更高,可轻松实现细胞移码突变、片段敲除、多基因敲除等多种敲除策略,更好地解决蛋白阳性残留等问题,基因编辑效率显著提升,助力您发文更快速!欢迎大家联系我们咨询~

 

现在赛业年中超值优惠全放送,点击图片即可一键申领10000元细胞技术服务代金券,领到就是赚到!同时订购细胞技术服务+模式动物服务,不仅享超值优惠,还送赛业15周年精彩大礼包,快拉上师弟师妹一起省经费吧。

 

关于赛业

赛业生物历经15年发展,已服务全球数万名科学家,产品和技术已直接应用于包括CNS(Cell,Nature, Science)三大期刊在内的4500余篇学术论文。除了提供基因敲除基因敲入条件性基因敲除模型定制服务外,赛业生物还有专业的手术疾病模型团队,可以提供多种复杂精细的小动物手术疾病模型;药物筛选评价小鼠平台可以提供从欧美行业领袖引进的免疫缺陷鼠、用于心血管及阿尔茨海默症等研究的人源化小鼠;国际标准化无菌鼠技术平台可以提供无菌鼠、无菌动物定制服务、微生物菌群移植服务等基于无菌动物模型的各类产品和服务,结合赛业生物成熟稳定的基因编辑小鼠平台,还可帮助您研究菌群与基因的互作机制。

10000元细胞技术服务代金券

如果您对产品或服务有兴趣,可通过以下方式联系我们
在下方表单
填写需求描述给我们
点击页面右侧“在线咨询”
工具快速咨询
拨打免费电话:
400-680-8038
发送邮件至邮箱:
info@cyagen.com
click to refresh
交流社区
神经
扫码加入
神经领域交流群
需备注来意,审核后进入
基因
扫码加入
基因领域交流群
需备注来意,审核后进入
细胞
扫码加入
细胞领域交流群
需备注来意,审核后进入
云课堂
扫码加入
云课堂交流群
需备注来意,审核后进入