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基因敲除,用质粒、病毒、还是……?

基因敲除,用质粒、病毒、还是……?

 

众所周知,CRISPR-Cas9作为一项基因编辑技术,目前已经是生命科学领域家喻户晓的技术了。但虽说这项技术非常火爆,仍有许多同学对基因编辑技术存在理解偏差,比如最常见的,在应用CRISPR-Cas9构建基因敲除(KO)细胞系,到底采用质粒法、病毒法还是有其他更好的方法呢?

 

说到这个问题,就不得不提当初CRISPR-Cas9技术刚兴起时,所展现的切割效率和敲除成功率极大的吸引了科研界的关注,但是科研人员进行相关实验时经常会遇到:“一学就会,一做就废”的问题。他们发现,完全按照文献的方法进行基因敲除,成功率并没有想象的高,且还存在对细胞转染效率低的问题。因此有一些课题组就尝试通过慢病毒转染的方式进行敲除,提高转染效率的同时,将Cas9蛋白基因整合到基因组中,通过提高增加Cas9蛋白和sgRNA的作用时间来提高细胞敲除效率。

 

★ 慢病毒法 ★

但是,慢病毒感染存在着两个比较关键的问题:

1. 利用慢病毒法转染Cas9会在敲除靶基因的同时引入新的基因,而且慢病毒转染的外源基因是随机整合,存在影响其他基因表达的风险。

2. CRISPR-Cas9编辑过程存在脱靶效应,慢病毒法会持续表达Cas9蛋白,长期存在的Cas9蛋白会对这种脱靶效应有累积效应,最终影响实验的严谨性。

图1. 慢病毒感染进行基因敲除

图1. 慢病毒感染进行基因敲除

 

★ 质粒法 ★

为了降低这种脱靶效应,采用的策略是减少Cas9蛋白与sgRNA复合物在细胞中的存留时间,因此我们还可以采用质粒法进行KO细胞的构建。即通过将Cas9和sgRNA表达载体瞬时转染到目的细胞中,从而在细胞内表达Cas9蛋白和gRNA,由于质粒整合到基因组的概率极低,随着细胞传代质粒载体的逐渐消失,再经过PCR验证和测序筛选出纯合的敲除细胞。但质粒法也存在一个较大的问题,即感染效率较低。

 

★ RNP法 ★

与质粒法不同的是,RNP法是通过电刺激转染的方法直接将Cas9蛋白和sgRNA复合物转染到细胞中。由于Cas9蛋白是不带电荷的,而sgRNA是带电荷的,因此只有当Cas9与sgRNA结合后,才能更高效的将两者转染到细胞中。同时,由于Cas9和sgRNA会被降解,Cas9-sgRNA复合物在细胞内的存留时间不会很长,因此发生脱靶的概率很低,但相应的切割效率也可能有一定降低。

图2. Cas9蛋白与gRNA形成RNP复合物

图2. Cas9蛋白与gRNA形成RNP复合物

 

从国内外文献报道的情况来看,质粒法和RNP法是目前主流的基因敲除策略,对于课题组实验室而言,质粒法可能更容易实施,而对于生物技术企业,RNP法则具有更高的实验效率。但这两种不同的方法只是殊途同归,只要能达到敲除效果的就是好方法。

 

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