在免疫系统人源化小鼠中探究过继性NK细胞疗法

过继性细胞疗法是一种非常有前景的免疫治疗手段。与T细胞疗法相比，过继性NK疗法具有许多独特的优点，包括更高的安全性、多种激活机制、同种异体细胞的使用等。尽管具有巨大的治疗潜力，也存在有效的体外扩增方法^[1]，但这些体外扩增出来的NK细胞在体内环境中的生存和增殖仍有待研究。上次我们讲了在荷瘤的重度免疫缺陷小鼠中移植人脐带血来源的NK细胞进行治疗（回顾请戳这里），这次，我们来看看过继性NK疗法在免疫系统人源化小鼠中的表现。

Fatemeh等人将人脐带血来源的NK细胞（cord blood-derived NK, CB-NK）进行体外扩增。同时，他们使用同一供体CB来源的CD34⁺造血干细胞移植到NRG小鼠中，构建自体（autologous）免疫系统人源化小鼠。他们发现体外扩增后的人NK细胞能在这种人源化小鼠中存活增殖，但在没有人源免疫细胞的对照组NRG小鼠中则不行。这些数据说明体外扩增的人NK 细胞在体内的存活需要人自体免疫细胞的存在。该研究结果发表在了Scientific Reports上^[2]。

构建免疫系统人源化小鼠

NOD-Rag1^-/-IL2rg^-/-（NRG）小鼠由于缺失有功效的T、B、NK细胞，且其Sirpa能与人CD47分子结合，因此对人源异种移植物高度兼容。Fatemeh等人将与CB-NK同一供体来源的CB-CD34⁺造血干细胞移植入辐照后的新生NRG小鼠肝脏中，构建自体（autologous）免疫系统人源化小鼠。移植后第12周检测人源化NRG小鼠外周血和脾脏中的人免疫细胞比例（图1）。统计结果表明，人源化NRG小鼠具有较高水平的人源免疫细胞，重建效果好（表1）。

图1. 人源化NRG小鼠的构建与检测（图来源于Ref.2的Supplementary Information)

表1. 移植后第12周人源化NRG小鼠体内人源免疫细胞重建比例。（表格来源于Ref.2)

体外扩增NK细胞

研究者们将同一供体来源的CB-NK细胞进行体外扩增，加入外源性IL-2进行处理，同时使用基因修饰后表达膜结合IL-21的K562人髓性白血病细胞（K562-mb-IL-21）作为饲养细胞。当人源化NRG小鼠构建成功后，将这些体外扩增的NK细胞通过尾静脉注射移植到小鼠体内（图2A）。为了探究体外扩增的人NK细胞是否还有功效，研究者们进行了细胞毒性试验并评估了这些细胞产生细胞因子的能力。结果显示，体外扩增的NK细胞对MDA-MB-231-Luciferase细胞仍具有细胞毒性（图2B），且经IL-18⁺ IL-15⁺ IL-12刺激后，IFN-γ和TNF-α的产生水平显著提高（图2C-D）。此外，进行染色，研究者们也测定了人源化NRG小鼠脾细胞中Treg的比例（图2E）。

图2. CB-NK细胞具有细胞毒性，并能产生促炎细胞因子。（图来源于Ref.2)

（A）分离自体CB制备脐带血单个核细胞 (cord blood mononuclear cells，CBMCs)。加入K562-mb-IL-21细胞和IL-2对CBMCs进行处理。3周后，通过流式细胞术分析NK细胞纯度，将体外扩增的NK细胞通过尾静脉注射移植到人源化NRG小鼠或未经人源化的对照组NRG小鼠中。（B）通过测定对MDA-MB-231-Luciferase细胞的细胞毒性来评估体外扩增的NK细胞的细胞毒性。通过ELISA实验分析体外扩增的NK细胞经IL-18⁺ IL-15⁺ IL-12或IL-2刺激后，产生的（C）IFN-γ和（D）TNF-α水平。（E）流式细胞术分析Treg细胞（hCD4⁺ hCD25⁺and hFOXP3⁺）比例。

NK细胞过继性转移

过继性转移后，研究者们在不同时间点检测了小鼠体内人源NK细胞水平（图3）。与之前的报道一致，在未加入IL-15进行处理的对照组人源化NRG小鼠（Hum-NRG-Control）中，人源NK细胞重建水平极低。因此，第1天的NK细胞几乎都是过继性转移的NK细胞。第7天，NK细胞在未经人源化的NRG小鼠（NRG-injected）中几乎完全消失，而在自体人源化NRG小鼠（Hum-NRG-injected）中仍然存在，且比例几乎翻倍。在Hum-NRG-injected小鼠中，第21天仍然可以检测到NK细胞，而在Hum-NRG-Control组中，第14天已经检测不到NK细胞了。特别地，如果使用同种异体的人NK细胞进行移植，则观察不到NK细胞在人源化NRG小鼠体内的增殖，且细胞存活时间不超过14天（图4）。

图3. 体外扩增的人NK细胞在过继性转移到自体免疫系统人源化小鼠后可存活21天。（图来源于Ref.2）

体外扩增的NK细胞经尾静脉注射过继性转移至自体免疫系统人源化NRG小鼠（Hum-NRG-injected）或重度免疫缺陷的NRG小鼠（NRG-injected）体内，或者不转移体外扩增的NK细胞至NRG小鼠体内（Hum-NRG-Control），在不同时间点采集血样。（A）代表性流式细胞图。（B）统计hCD56⁺ hCD3^- NK细胞占hCD45⁺细胞比例。使用two-way ANOVA分析，并对结果进行Bonferroni调整。

图4. 体外扩增的人NK细胞在过继性转移到同种异体的人源化小鼠后不能存活。（图来源于Ref.2的Supplementary Information)

虽然在第1天能检测到NK细胞的百分比增加，但在第7天时NK细胞并没有明显的细胞增殖，且14天以后无法检测到NK细胞的存在。

综上，这些数据表明加入外源性IL-2进行处理，同时使用K562-mb-IL-21作为饲养细胞的这种NK细胞体外扩增方式具有良好的应用前景。不仅保留了NK细胞对肿瘤靶标的细胞毒性，且能在不加入外源性细胞因子的情况下，在自体免疫系统人源化小鼠中存活增殖。此外，这也说明扩增出来的人NK细胞在体内的存活需要人自体免疫细胞的支持，这很可能依赖于细胞间的相互作用以及内源性人IL-15和IL-2的存在。

小结

选择合适的临床前动物模型十分重要。对比使用免疫缺陷小鼠，在人免疫系统存在的情况下来测试过继性转移细胞疗法可以分析人源免疫细胞间的相互作用，更接近临床情况，也具有更好的预测性。但同时，免疫系统人源化小鼠在此类研究中也具有局限性。例如，由于小鼠体内其他人源免疫细胞的存在，很难单独描述过继性转移的细胞对抗肿瘤效果的影响^[2]。但总体来看，免疫系统人源化小鼠是研究过继性转移细胞疗法的一类优秀模型。

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