为什么都说基因敲入难？因为你忽视了这些

CRISPR-Cas基因敲入（KI, Knock in）是指将外源性基因通过同源重组（HDR）的方式插入到基因组中，使其在细胞内稳定表达的一种基因编辑技术。KI的外源基因可以是具有蛋白表达功能的编码基因，可以是参与基因调控的DNA元件，也可以是一段没有功能的DNA序列等。

基因敲入技术在基因功能研究和疾病治疗等众多方面发挥着重要的作用，但是在实际的操作过程中，想获得一个纯合的KI细胞系并不是一件容易的事。因为KI细胞系构建是否成功是受到多方面因素影响的，如敲入基因片段的长短、同源重组效率、细胞系类型等均能影响编辑效率，所以这也使得KI的技术难度很高。今天让我们了解一下构建KI细胞系的原理和需要注意的细节。

CRISPR-Cas基因敲入原理

在sgRNA引导下，Cas内切酶定点切割DNA双链而产生DNA缺口，然后生物体启动同源重组修复途径，当存在一段高度同源的DNA模板（Donor DNA）时，会以Donor DNA为模板进行修复，从而达到将目的片段定点引入基因组的目的（图1）。

图1. CRISPR-Cas基因敲入原理

在这个过程中，Cas的切割效率、细胞双链DNA断裂后以同源重组方式进行修复的概率、以Donor模板重组的概率一同影响最终的基因编辑效率。这也是阳性克隆获得率低的原因。

构建KI细胞系需要注意的细节

KI细胞系的构建流程是先设计sgRNA及Donor模版，然后通过核糖核蛋白法（Ribonucleoprotein, RNP）或质粒法等方法将sgRNA、Cas蛋白和Donor模板转进细胞中。以RNP法为例，将合成的sgRNA、纯化后的Cas蛋白和Donor模板电转进目标细胞中，通过抗性筛选、PCR鉴定及测序确定KI细胞系是否构建成功。在这个过程中，sgRNA的设计、Donor模板的设计等均会影响最终的编辑结果，下面我们总结了会影响基因编辑效率的部分原因：

1. sgRNA的设计

sgRNA-Cas在KI基因编辑系统中如“剪刀”一般精准切开双链DNA，这把“剪刀”锋利与否和精确度能直接影响KI基因编辑系统的编辑效率。而sgRNA的设计就是重要的一步，它能影响目的片段能否精准插入和切割效率。因此需要综合多方面因素来科学设计sgRNA。在设计时要综合考虑候选编辑位点的序列、位置、正负链、GC含量、潜在的脱靶位点等信息。可以参照以下原则设计sgRNA：

（1） 候选编辑位点的正链靶点和负链靶点的切割效率相同，都可以设计靶点；

（2） 靶点的GC含量尽量不要低于40%，靶点序列GC含量偏高（50-70%）有较高的打靶效率；

（3） 靶点内不要有连续4个以上的T碱基，以防成为RNA Pol III的转录终止信号；

（4） 为了避免或减少非特异脱靶突变，应进行靶点特异性分析。推荐使用CCTop（https://cctop.cos.uni-heidelberg.de:8043/）在线网页进行预测。最后挑选切割效率高、特异性好的一条或多条sgRNA开展实验。

2. RNP法和质粒法的选择

细胞内存在Cas蛋白和sgRNA是实现基因敲入的重要一步。表达Cas蛋白和sgRNA的常用方法有核糖核蛋白法（ ribonucleoprotein, RNP ）和质粒法等。这两种方法各有优劣，根据赛业众多成功KI案例经验，我们更加推荐使用RNP法。质粒法流程相对简单，周期较短，成本低，但无法稳定表达Cas蛋白。而RNP法脱靶概率低、无DNA整合风险和启动子兼容性问题，5-6日即可完成切割效率检测，显著缩短实验周期。在转染12-24h后快速发生基因编辑，质粒载体一般需要72h，因此RNP法比质粒表达载体具有更高的效率。并且不引入多余的表达元件或因此导致的细胞毒性。

3. Donor模板的设计

Donor模板对同源重组的效率具有重要的影响。在实验过程中需要考虑以下因素：

（1）插入位点与双链DNA缺口（Double Strand Breaks，DSB）的距离。距离不应该超过100 bp，而最理想的距离是在10 bp以内。如果超过这个距离，重组效率会大大降低。

（2）敲入片段的长度。短片段的敲入（如Tag标签等）可以使用ssODN。长片段的敲入则需要dsDNA质粒作为修复模板，需要注意的是敲入的片段不能过长，一般不超过5 kb（包含抗性和荧光筛选），过长会降低重组效率。

（3）同源臂的长度。一般而言，加长同源臂能一定程度上提高重组效率。并且插入的片段越大，所需要的同源臂长度越长，而同源臂一般选取约1500 bp较为合适。

（4）同源臂模板的选择。同源臂建议以待突变的目的细胞基因组为模板扩增，避免不同细胞基因组差异导致同源臂不同源，降低重组效率。

4. 细胞类型与生长状态

在瞬转之前应注意细胞类型是否合适，如关注细胞的增殖速度，增殖太慢的细胞发生重组效率也低下。还要保证细胞处于良好的生长状态、处于对数生长期、合适的生长密度、无支原体污染等。

5. 瞬转电压

合适的瞬转电压能影响编辑效率和细胞的存活，电压过低会影响编辑效率，电压过高会使细胞死亡。因而需要摸索不同细胞类型的合适瞬转电压。一般而言，转瞬电压和细胞的直径有关系，直径越大电压越低。建议结合预实验，选择最佳的瞬转电压。

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