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不了解单碱基编辑系统?看这一篇就够啦

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全球有超过50000种人类相关的遗传疾病,其中大部分是由基因组的点突变引起的。而对于罕见病而言,80%是由基因缺陷引起的,同时这些基因缺陷中点突变又占了60%。比如多发性神经纤维瘤(Neurofibromatosis)则是由 Neurofibromin 1/2基因发生碱基突变引起的。由此可以看出,对基因组点突变的研究不仅能揭示一些重要的生物学原理,更有利于人类疾病治疗手段的研发。

 

CRISPR-Cas9系统被誉为基因组编辑的魔术手术刀,特别是基于CRISPR-Cas9系统和细胞同源重组修复机制(HDR)的基因编辑技术,在基因点突变遗传病方向展现出巨大的应用潜力。但是存在同源重组效率不高、更容易启动非同源重组机制产生不可预知的突变类型等问题,使得需要开发一种更为简便、高效和精准的技术。而单碱基编辑系统便是在这样背景下被开发出来的。

 

单碱基编辑系统包括胞嘧啶碱基编辑器(CBE)、腺嘌呤碱基编辑器(ABE)、鸟嘌呤编辑器(GBE)和先导编辑器(Prime Editor)。这些编辑器不会产生DNA双链断裂缺口(DSB),因此不会触发细胞的DNA双链修复机制。下面分别介绍上述四种编辑器。

 

胞嘧啶编辑器

胞嘧啶编辑器(CBE)在CRISPR/Cas9系统的基础上被开发出来,包含sgRNA和融合蛋白两个部分。将Cas9核酸酶的RucC和HNH两个功能域突变,产生突变型的dCas9(dead Cas9)或nCas9(nickase nCas9),然后将突变型Cas9、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制子融合形成融合蛋白。胞嘧啶编辑器的工作原理是在sgRNA引导下,融合蛋白到特定的基因组位置上,然后胞嘧啶脱氨酶将C转变为U,然后U在DNA复制的过程中再转变为T(图1)。在这个过程中,尿嘧啶糖基化酶抑制子的作用是抑制中间体U的切除,提高T的转换率[1]

图1. CBE的工作原理

图1. CBE的工作原理[1]

 

在第一代的胞嘧啶编辑器CBE1(rAPOBEC1-XTEN-dCas9)中,融合蛋白由来源于大鼠的rAPOBEC1(大鼠胞嘧啶脱氨酶)和dCas9组成[1]。其编辑活性窗口约为5个碱基,靶位点为第4-8位碱基。CBE1在体外具有较高的编辑效率,但是在哺乳动物体内的编辑效率则十分低下。经过研究人员的分析,这是可能由于DNA糖基化酶(Uracil DNA glycosylase, UDG)识别中间体UG,并通过碱基切除修复途径(BER)重新修复成CG。因此,抑制碱基切除修复途径能提高胞嘧啶编辑器的编辑效率。然后研究者们在rAPOBEC1-XTEN-dCas9基础上将尿嘧啶DNA糖基化酶(UGI)也融合其中,研发出第二代胞嘧啶编辑器CBE2(rAPOBEC1-XTEN-dCas9-UGI)[1]。CBE2展现出较高的编辑效率,最高可达到20%,比BE1高3倍。在实践的过程,由于CBE1与CBE2不会产生DSB,因此在基因组中发生非目标碱基插入、缺失和替换的概率极低。

 

但研究者们依然希望提高编辑效率,于是将dCas9替换成nCas9(Cas9 nickase nCas9 D10A),构建出第三代胞嘧啶编辑器CBE3(rAPOBEC-XTEN-nCas9(D10A)-UGI)[1]。nCas9具有切割非编辑DNA链(G所在的DNA链)的活性,能形成DNA单链缺口。然后细胞会启动碱基错配修复途径(MMR),以编辑链(含有编辑后U的DNA链)为模板进行修复(图2)。CBE3具有极高的编辑效率,比CBE2高2-6倍,但是CBE3除了能将C转变成T以外,还可能将C转变为G或A,并且还可能触发非同源修复机制(NHEJ)产生Indel。

 

为了进一步提高编辑效率,研发者在CBE3的基础上融合了第二个拷贝的UGI,同时优化rAPOBEC1、nCas9和UGI之间的接头长度,构建出第四代胞嘧啶编辑器CBE4(rAPOBEC-XTEN-nCas9(D10A)-2UGI)[2]。与CBE3相比,CBE4使得C到G和C到A基因编辑产物减少了2.3倍。并且在CBE4的基础上通过融合来源于噬菌体Mu的Gam蛋白或增加不同数量的核定位信号(NLS)以及使用不同公司优化的密码子序列等方法,降低NHEJ修复途径的发生,提高编辑效率。

图2. CBE的升级

图2. CBE的升级[1]

 

腺嘌呤编辑器

腺嘌呤编辑器(ABE)与CBE类似,ABE的融合蛋白由nCas9(D10A)和人为改造的腺嘌呤脱氨酶组成,且无需抑制烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(AAG)的活性,就这样构建出ABE7.10(ecTadA-ecTadA*-nCas9)[3]。其工作原理是在sgRNA的引导下,融合蛋白结合到靶序列区,并将一定区域的腺嘌呤(A)脱氨形成肌酐(I),然后I再转变成G,实现A到G的转换(图3)。为了进一步提高ABE的编辑效率,研究者于是在ABE7.10的基础上融合了NLS以及使用不同公司优化的密码子序列等方法,提高了A到G的转换效率[4]

图3.  ABE的工作原理

图3. ABE的工作原理[3]

 

GBE

GBE技术是在CBE的基础上发展而来的。CBE在将C转变为U后,由于体内的UNG酶能将U碱基切除,形成无嘌呤无嘧啶的AP状态(apurinic/apyrimidinic)。在AP态时,能够触发碱基切除修复机制,将U重新变回为C,但是也能被修复为其他三种碱基[5]。CBE是通过抑制UNG的活性,提高C到U再到T的转换效率。而GBE则是利用AP态向其他碱基转变的可能。研究者将UNG与nCas9融合,发现在大肠杆菌中C变换成A是主要的编辑结果。但是在哺乳动物细胞HEK293T中则是以C转换成G为主要的编辑结果[6](图4)。可以看出在AP状态下,细胞中存在着一种未知的修复机制使得AP态往不同的碱基进行修复。因此这项技术仍需继续完善。

GBE在大肠杆菌中的编辑效果

GBE在HEK293T中的编辑效果

图4. GBE在大肠杆菌或HEK293T中的编辑效果[6]

(A)GBE在大肠杆菌中的编辑效果。(B)GBE在HEK293T中的编辑效果

 

先导编辑器

虽然CBE和ABE能实现C到T和A到G的转换,但是其他不同碱基之间的转换仍然受限,于是研究者继续开发出能适应所有碱基转换的技术——先导编辑器(Prime Editor,PE)。PE除了能实现碱基的替换,还能有效实现多碱基的精准插入和删除[7]。PE也是以CRISPR/Cas9系统为基础,由改造的sgRNA(pegRNA)和融合蛋白组成。pegRNA是在原先sgRNA的基础上添加能互补断裂的靶DNA链3’末端的序列(PSB)和带有突变位点或插入缺失的目的序列(RT模板)。而融合蛋白是nCas9(H840A)与逆转录酶融合而成。PE的工作原理是pegRNA引导融合蛋白到达靶序列区,然后nCas9断裂被编辑的DNA,接着PSB结合上断裂的靶DNA,在逆转录酶和RT模板下逆转录出含有突变位点的目的序列。反应结束后会形成带有目标突变的3’flap结构的DNA链和无任何突变的5’flap结构的DNA链。细胞内5’flap结构易被结构特异性内切酶识别并切除,之后经DNA连接和修复便实现了精准的基因编辑(图4)。

图5. PE的工作原理

图5. PE的工作原理[8]

 

小结

现今,基于CRISPR-Cas9系统和细胞同源重组修复机制的基因编辑技术发展已经较为成熟。通过CRISPR-Cas9系统在特定的基因组位置上产生双链DNA缺口,启动细胞中的同源重组修复机制,以含有目的突变的高度同源的DNA序列进行修复,从而达到碱基转换的目的。这项技术已经应用于基因治疗和基因功能研究等领域上。但是也存在部分的缺点,如同源重组效率不高、容易启动NHEJ修复方式导致不可预估的突变等。而单碱基编辑系统在CRISPR/Cas9系统基础上,通过突变Cas9核酸内切酶的切割活性,使得不会产生DNA双链缺口,降低引入Indel的风险。同时在突变型Cas9中融合脱氨酶等其他功能蛋白,实现不同碱基的转换。其简便、高效、不容易引入Indel等特点是基因治疗领域所看重的,所以单碱基编辑系统将会在基因功能研究和基因治疗等领域提供强劲持续的动力。

 

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参考文献:

[1] Komor, Alexis C., et al. “Programmable Editing of a Target Base in Genomic DNA without Double-Stranded DNA Cleavage.” Nature, vol. 533, no. 7603, 2016, pp. 420–424.

[2] Komor, Alexis C., et al. “Improved Base Excision Repair Inhibition and Bacteriophage Mu Gam Protein Yields C:G-to-T:A Base Editors with Higher Efficiency and Product Purity.” Science Advances, vol. 3, no. 8, 2017.

[3] Gaudelli, Nicole M., et al. “Programmable Base Editing of A•T to G•C in Genomic DNA without DNA Cleavage.” Nature, vol. 551, no. 7681, 2017, pp. 464–471.

[4] Koblan, Luke W., et al. “Improving Cytidine and Adenine Base Editors by Expression Optimization and Ancestral Reconstruction.” Nature Biotechnology, vol. 36, no. 9, 2018, pp. 843–846.

[5] Nishida, Keiji, et al. “Targeted Nucleotide Editing Using Hybrid Prokaryotic and Vertebrate Adaptive Immune Systems.” Science, vol. 353, no. 6305, 2016.

[6] Zhao, Dongdong, et al. “Glycosylase Base Editors Enable C-to-A and C-to-G Base Changes.” Nature Biotechnology, vol. 39, no. 1, 2021, pp. 35–40.

[7] Doman, Jordan L., et al. “Evaluation and Minimization of Cas9-Independent off-Target DNA Editing by Cytosine Base Editors.” Nature Biotechnology, vol. 38, no. 5, 2020, pp. 620–628.

[8] Anzalone, Andrew V., et al. “Search-and-Replace Genome Editing without Double-Strand Breaks or Donor DNA.” Nature, vol. 576, no. 7785, 2019, pp. 149–157.

 

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