CRISPR/Cas基因编辑技术在CAR-T细胞免疫疗法中的应用

CAR-T细胞免疫疗法的基本原理是使用基因工程手段在T细胞表面表达CAR分子，CAR-T细胞可以通过表达于其表面的scFv特异地识别肿瘤细胞表面的抗原进而对肿瘤细胞进行杀伤。

经过多年的发展，CAR-T细胞免疫疗法已经在肿瘤治疗领域取得了令人瞩目的成果，但是其依然面临着诸多挑战。CAR-T细胞在临床的使用过程中，通常会发生严重的毒副作用，例如细胞因子释放综合症、脱靶毒性以及肿瘤裂解综合征等，这一定程度限制了其临床应用。因此下一代CAR-T细胞开发的方向在于如何通过CAR分子的结构优化、T细胞改造来降低毒副作用，同时增强CAR-T细胞抗肿瘤效果。另外，患者自体的T细胞通常会由于疾病本身或者治疗造成细胞数量不足或者功能缺失，导致CAR-T细胞制备失败。

因此，开发通用型的下一代CAR-T细胞也是CAR-T细胞免疫疗法的一个重要方向。但是，异体T细胞使用通常会造成严重的GVHD，而CRISPR/Cas技术的出现为解决这一问题提供了可能性。目前，CRISPR/Cas敲除αβ T细胞内源性的TCR制备的通用型CAR-T细胞在临床前已经取得了很好的治疗效果^[1]。本文我们给大家介绍一下CAR-T细胞免疫疗法的研究概况，同时对基因编辑技术CRISPTR/Cas在增强CAR-T细胞安全性和有效性方面的应用予以描述。

CAR分子是一类基因工程构建的融合蛋白，其结构类似于TCR蛋白，包含有识别肿瘤抗原的胞外域和一个或者若干个胞内信号通路结构域。CAR分子的胞外蛋白结构域通常是来源于抗体单链可变区，其胞内信号通路结构域通常包含CD28、4-1BB或者OX40等共刺激信号结构域和CD3ζ信号结构域。

第一代的CAR分子的信号通路结构域中仅含有CD3ζ信号，因此其不能对T细胞进行充分的活化，导致其在应用中并未取得良好的效果。在此基础上学者们对CAR分子的结构进行了进一步的改进，引入一个或者两个协同共刺激分子，分别形成了二代CAR和三代CAR分子。近年来又演化出了四代CAR分子，其结构除传统CAR分子的元件之外还引入了能够诱发T细胞分泌细胞因子的结构。另外，TCR α或β链敲除的通用型CAR-T细胞的研究，代表着下一代CAR-T细胞研究的重要方向，其被称为第五代CAR-T技术^[2]。历代CAR-T细胞的演进历程如图1所示^[3]。

图1. CAR-T细胞的发展历程^[3]。

目前，CRISPR/Cas技术一方面被广泛的用于通用型CAR-T细胞的开发，扩展CAR-T细胞的应用范围；另一方面也被广泛的用于包含T细胞在内的免疫细胞的修饰，以增强其抗肿瘤效果。虽然，CRISPR/Cas技术的应用仍然面临着许多安全性、有效性等问题，但毫无疑问该技术将在下一代新型的CAR-T技术开发中具有重要的作用。

肿瘤细胞可以通过表达负性信号通路调节分子来抑制免疫反应或者逃脱免疫细胞的杀伤，这些负性信号通路分子被称作免疫检查点。PD1是一个重要的免疫检查点分子，其信号通路的活化可以显著抑制T细胞的增殖和免疫反应。

目前CRISPR/Cas编辑的TCRα基因和PD-1基因敲除CAR-T细胞临床应用的安全性及其治疗的可行性已经在一项研究中得到了验证。在一项研究中，研究者发现：CRSISPR/Cas对内源性的TCRα和PD-1基因有着较高的编辑效率，但对TCRβ基因的编辑效率较低。同时，该项研究结果显示CRISPR/Cas编辑的T细胞在体内能够存活近9个月，而且仅有低水平的临床毒副作用^[4]。

在另外一项研究中，Rupp等人通过电转的方式将Cas和靶向PD-1基因1号外显子的sgRNA转入T细胞中，随后用含有CD19 CAR基因的慢病毒转染该细胞。结果显示：在PDL1^＋CD19^＋肿瘤细胞构建的小鼠模型中，PD-1基因敲除的CD19 CAR-T细胞能够有效的清除肿瘤细胞。这一结果表明PD-1/PDL1信号通路在调节T细胞功能方面具有重要的作用^[5]。

最近有一种新型的靶向CD7的抗自杀的CAR T细胞的研究报道，在该项研究中，研究人员使用CRISPR/Cas技术对T细胞的TCR和CD7分子进行了敲除，TCR的敲除能够避免CAR-T用于异体治疗时引起的GVHD风险，CD7的敲除使CAR-T细胞能够避免相互自杀。

在该项研究中，CD7 CAR-T细胞在体内外多种CD7⁺白血病细胞系和肿瘤动物模型中均展现出了良好的抗肿瘤活性，同时并未引起GVHD反应。因此，该项CD7 CAR-T技术的开发对复发难治性的急性T淋巴细胞白血病以及非霍奇金T细胞淋巴瘤的治疗将具有极其重要的意义^[6]。

考虑到粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）在诱发细胞因子风暴（中的重要作用，一些研究者聚焦于如何减弱GM-CSF对细胞因子风暴的诱发。GM-CSF在造血干细胞分化以及增殖方面具有重要作用。

2019年，Sterner等人使用CRISPR/Cas对CD19 CAR-T细胞的GM-CSF基因进行敲除。该项研究结果表明，GM-CSF基因敲除的CAR-T细胞的GM-CSF的分泌的确明显减弱，但是对CAR-T细胞的重要功能并未造成影响，更重要的是GM-CSF缺陷的CD19 CAR-T细胞比野生型的CD19 CAR-T细胞在体内具有明显的抗肿瘤效果^[7]。

通用型CAR-T（UCAR-T）细胞可以使用健康供者的T细胞来制备，同时还可以实现批量生产，产品均一性更好，可以大大拓宽CAR-T细胞免疫疗法的应用范围。因此，通用型CAR-T细胞治疗产品是下一代CAR-T细胞开发的重要方向。

目前通用型CAR-T细胞的开发主要是通过对T细胞TCR基因和β2M基因的敲除或者沉默来实现的，而CRISPR/Cas基因敲除技术是通用CAR-T开发应用的主流技术。Eyquem等人使用CRISPR-Cas技术对TCRα恒定区进行敲除，其sgRNA靶向位置为TCRα第一个外显子的5‘端，随后使用AAV将被同源臂包围的CD19 CAR基因序列递送到该细胞中，通过同源重组的方式将CD19 CAR基因插入TCR位点，结果显示接近95%的T细胞的TCR被敲除。进一步的NALM6小鼠体内肿瘤模型实验结果显示：仅仅回输1×10⁵个CAR-T细胞便能够有效的控制肿瘤细胞的生长，同时仅有2%的T细胞表达PD1、LAG3和TIM3等抑制性受体^[8]。这些抑制性受体的低表达可能是取得良好的抗肿瘤效果的主要原因。这一研究结果为我们描绘了如何通过基因编辑技术来增强CAR-T细胞抗肿瘤效果的美好图景。

随着CRISPR/Cas技术在CAR-T细胞免疫领域的应用研究不断的深入，在未来它将在解决异体治疗的排斥反应、克服CAR-T的强直信号、改善T细胞功能耗竭、克服肿瘤微环境的抑制以及降低CAR-T治疗的毒副作用等方面发挥重要的作用。

此外，基于CRISPR/Cas的大规模高通量的基因筛查方法的开发，为高效、特异性的对T细胞成百上千个基因的筛选提供了可能性。同时，应用CRISPR/Cas技术对潜在的能够逆转CAR-T细胞耗竭的新基因的鉴定也有着极大的研究空间。但CRISPR/Cas系统作为细胞治疗中的一项新兴技术，目前其多数应用在学术和制药行业的许多研究实验室中。随着CRSPR/Cas应用的快速发展和新基因编辑技术的出现，我们希望见证CAR-T细胞在肿瘤免疫治疗领域取得更大的突破。

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