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基因治疗在IVA型粘多糖病中的应用

IVA型粘多糖病

IVA型粘多糖病(MPSIVA)和Morquio A病是由N-乙酰氨基半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶(GALNS)缺乏引起的,导致硫酸可拉坦(KS)和硫酸软骨素-6-积累。患者会出现严重的骨骼发育不良、早期软骨退化以及危及生命的心脏和气管并发症,但目前尚无治愈方法。

 

基因治疗作为一种新兴的疗法,通过AAV等递送系统补偿突变基因的效价,在众多罕见病治疗上展现出巨大的应用潜力。Bertolin等人在MPSIVA疾病模型中注射AAV9-Galns,发现GALNS的活性能长期(1年)恢复,并且KS的表达水平恢复正常,从而改善MPSIVA的症状。这项研究证明AAV9-Galns基因治疗在治疗MPSIVA的应用潜力,为MPSIVA患者未来的临床治疗提供了强有力的理论基础。

 

接下来我们就详细解读这篇文献,再深入理解基因治疗研究的常规套路吧。

 

研究思路

01 构建MPSIVA大鼠疾病模型

02 AAV9递送系统的递送效率检测

03 MPSIVA大鼠疾病模型的表型检测与注射AAV9-Galns后的有效性评价

 

MPSIVA大鼠疾病模型的构建

 

作者利用CRISPR/Cas9技术构建含有错义突变c.1156C>T的MPSIVA大鼠模型并且通过测序分析验证了该点突变,GALNS点突变的产生导致GALNS蛋白的功能发生突变(p.Arg386Cys)。研究人员将杂合子大鼠(GALN+/−)与野生型大鼠(GALN+/+)回交,以消除CRISPR/Cas9相关的脱靶效应(图1a-c)。对GALN敲除大鼠进一步分析,发现在这些大鼠所有的组织中均无法检测到GALNS活性水平,并且早在1个月大时,肝脏和血清中的KS含量一直很高,胫骨长度减少(图1d-g)。

IVA型粘多糖病

图1.  MPSIVA大鼠疾病模型的构建。

 

AAV9在骨骼系统中具有良好的递送效果

 

由于MPSIVA疾病的基因治疗面临的主要挑战是没有良好的递送系统,以增加局部GALNS的浓度。作者将AAV9-GFP注射至野生型雄性大鼠,通过观察荧光强度来评价AAV9递送系统的效率。在股骨、胫骨生长板(GP)和骨内膜周围的成骨细胞富集区、致密骨的内部细胞和关节软骨中检测到GFP阳性信号(图2a)。

 

此外,在所有大鼠骨骼(股骨、胫骨、前肢骨、胸骨、肋骨和椎骨)和Morquio A大鼠的关键外周器官中也发现了高水平的GFP表达(图2b、c)。

 

然后对MPSIVA大鼠注射AAV9-Galns,载体基因组拷贝数分析表明,AAV9-Galns在骨骼(图2d)和外周器官(图2e)中有较好的转导效率。表明AAV9在治疗MPSIVA上具有很大的应用潜力。IVA型粘多糖病

图2. AAV9在骨骼系统中具有良好的递送效果。

A. (I)致密骨(CB); (II)生长板周围区域(GP);(III)关节;(IV)骨小梁;(V)骨内膜。B. F,股骨;Ti,胫骨;R,肋骨;S,胸骨;V,椎骨;FL,前肢骨骼;K,膝盖骨;Fi,腓骨;Sc,肩胛骨;Hu,肱骨;T,气管;H,心脏;L,肝脏;A,附睾白色脂肪组织(eWAT);Lu,肺;Q,股四头肌。

 

注射AAV9-Galns能有效治疗MPSIVA

 

身材矮小是MPSIVA患者的特点。MPSIVA雄性大鼠在第一个月龄期间显示出与WT大鼠相似的体重,但随后观察到体重和体型的显著下降(图3a、b)。并且MPSIVA大鼠的寿命也显著缩短,约30%的大鼠在2个月大时死亡(图3c)。

 

经过AAV9-Galns基因治疗,MPSIVA大鼠的体重增加且存活率恢复正常(图3a-c),并且GALNS的活性和KS的水平恢复正常(图3d-f)。在肝脏和白色脂肪组织(WAT)中也发现GALNS活性较高(图3g、h)。GALNS活性提高使肝脏中KS含量正常化,仅储存在Kupffer细胞和WAT中(图3i-l)。此外,肝脏β-己糖胺酶(溶酶体内稳态生物标记物)活性恢复(图3m)。

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图3. 注射AAV9-Galns能有效治疗MPSIVA。

 

AAV9介导的Galns表达可防止骨骼病变

 

对MPSIVA大鼠使用AAV9-Galns,可增加Galns在骨骼中的表达,如股骨、胫骨和肱骨(图4a),可以降低GP和骨干中的KS累积(图4b-d)。

 

2个月大的MPSIVA大鼠的GP软骨切片显示GP面积和钙化区均显著减少,表明随着大鼠年龄的增长,骨化发生了变化(图4e)。对MPSIVA大鼠胫骨GP的分析显示,静止区和增殖区的软骨细胞肥大,AAV9-Galns处理的MPSIVA大鼠的软骨细胞肥大明显减少(图4f)。

 

透射电子显微镜(TEM)进一步证实了这一点,证明接受治疗的动物增殖软骨细胞中的储存液泡大量减少(图4g)。这些结果与AAV9-Galns基因治疗的MPSIVA大鼠中观察到的体型正常化一致(图3a、b)。

 

经MPSIVA治疗的大鼠显示正常的骨密度和含量,以及小梁厚度、数量和间距。相反,未经治疗的MPSIVA大鼠的所有骨参数均发生改变(图4h-j)。这些结果为这种基因疗法治疗MPSIVA病的骨病理学提供了强有力的证据。

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图4. AAV9介导的Galns表达可防止骨骼病变。

 

使用AAV9-Galns治疗可防止牙齿异常改变

 

牙齿异常改变是MPSIVA患者的常见特征。在2个月大的MPSIVA大鼠中,牙齿错牙合、脆性和釉质发育不良已经很明显(图5a)。相反,AAV9-Galns处理的MPSIVA大鼠门牙完整,咬合和釉质正常(图5a)。

 

通过下颌骨切片中门牙的LIMP2免疫染色显示,产生釉质的成釉细胞和乳头层细胞中存在明显的溶酶体扩张,导致釉质发育不良(图5a、b)。AAV9-Galns治疗纠正了这些细胞的储存病变(图5b)。MPSIVA大鼠切牙的超微结构分析显示成釉细胞中有大量的储存液泡。在使用AAV9-Galns基因治疗后,病理性溶酶体积聚降低(图5c)。

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图5. AAV9-Galns基因治疗可防止牙齿异常改变。

 

AAV9-Galns基因治疗关节软骨病变

 

KS累积改变MPSIVA患者的关节软骨,导致严重的骨关节炎,最终需要骨科手术。在4周龄的MPSIVA大鼠中,与WT大鼠相比,用藏红O染色和LIMP2免疫染色对胫骨软骨切片的分析发现软骨细胞肥大增加(图6a-c)。在8周龄时,在MPSIVA大鼠的关节软骨切片中观察到LIMP2信号加剧,这与进行性KS积聚和溶酶体扩张一致(图6d、e)。对MPSIVA大鼠注射AAV9-Galns,可显著纠正关节软骨中的储存病变(图6d、e)。并且在治疗后,死亡率显著降低(图6f)。

 

对6个月大的MPSIVA大鼠肱骨软骨切片进行组织学分析,并用藏红O染色,发现存在骨关节炎,在关节软骨最浅层有大量肥大软骨细胞(图6g)。注射AAV9-Galns能够减少该层中肥大软骨细胞的数量(图6g)。胫骨关节软骨表层软骨细胞的超微结构分析显示,与未经治疗的动物相比,AAV9-Galns基因治疗的MPSIVA大鼠减少了储存囊泡(图6h)。

 

对MPSIVA大鼠给药11个月后,发现软骨细胞肥大程度减少,并防止了膝关节软骨丢失(图6j、k)。这与注射AAV9-Galns的大鼠关节软骨中基质金属蛋白酶表达的正常化一致,有助于骨关节炎的预防(图6l)。此外,在滑膜中观察到的溶酶体扩张在AAV9-Galns治疗后正常化(图6m)。与关节改变一致,MPSIVA大鼠在2个月大时已经表现出握力下降(图6i)。AAV9-Galns基因治疗的MPSIVA大鼠表现出与WT大鼠相似的行为(图6i),这表明AAV9-Galns基因治疗可改善MPSIVA的骨关节炎病变。

IVA型粘多糖病

图6. AAV9-Galns基因治疗关节软骨病变。

 

AAV9-Galns治疗气管和心脏病

 

在MPSIVA患者中观察到的最严重的非骨骼表现是呼吸和心血管并发症,这也是致死的主要原因。在MPSIVA大鼠中观察到气管透明软骨、呼吸上皮和固有层的改变。AAV9-Galns基因治疗提高气管和肺中的Galns表达和活性,修正软骨细胞、睫状体细胞和成纤维细胞的储存异常(图7a-f),逆转MPSIVA患者呼吸道的病变。

 

同样,在注射AAV9-Galns后,MPSIVA大鼠心脏中观察到高水平的Galns表达和活性(图7g)。然而,Morquio患者的主要心脏异常是瓣膜。TEM分析显示MPSIVA大鼠二尖瓣的储存异常(图7h),而AAV9-Galns可以修正二尖瓣细胞的储存异常(图7h)。

 

此外,在MPSIVA大鼠的LIMP2免疫染色,还观察到主动脉壁切片平滑肌纤维的溶酶体扩张,而在AAV9-Galns处理的MPSIVA大鼠中正常化。AAV9-Galns处理的MPSIVA大鼠主动脉纤维的超微结构分析,发现没有液泡,说明储存异常得到修正(图7i)。

 

MPSIVA大鼠的瓣膜功能障碍和主动脉壁改变可能导致心率增加(图7j),患者的心率也会改变。而用AAV9- Galnsa基因治疗MPSIVA大鼠也能使心率正常化(图7j)。

IVA型粘多糖病

图7. AAV9-Galns治疗气管和心脏病。

 

小结

Galns表达和活性的降低会引发骨骼病变和危及生命的心脏和气管并发症,作者通过AAV9递送系统,使Galns缺陷的MPSIVA大鼠过表达Galns,有显著的治疗效果。

 

作者以清晰的研究思路和扎实的实验数据,证明了AAV9-Galns基因治疗在MPSIVA疾病的治疗作用。这个过程包括了动物模型构建、AAV9递送系统效率的验证、疾病表型检测和治疗后有效性评价,这也是基因治疗研究的常规套路。

 

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参考文献:

Bertolin J, Sánchez V, Ribera A, et al. Treatment of skeletal and non-skeletal alterations of Mucopolysaccharidosis type IVA by AAV-mediated gene therapy. Nat Commun. 2021;12(1):5343. Published 2021 Sep 9. doi:10.1038/s41467-021-25697-y.

 

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