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一文带你了解HSC人源化小鼠

肿瘤研究中常见的方法有以下几种

 

基因编辑结合生信分析。此类研究采用CRISPR-Cas9/siRNA/shRNA等工具对荷瘤鼠模型或者癌细胞的靶基因进行基因表达沉默或者增强表达。沉默或者增强表达靶基因后,寻找其调节的下游信号蛋白,检测其激活/抑制状态。对编辑样本进行高通量测序,并利用生物信息分析技术,寻找被靶向调节的基因和通路。再在后续试验中在细胞或者动物水平对该类通路或者基因进行功能学验证。例如,第二军医大学东方肝胆外科院心王红阳院士团队利用基因编辑/RNAi技术研究确定十号染色体上磷酸和张力蛋白同源性缺失(PTEN)能够促进蛋白质合成、蛋白酶体亚单位表达和蛋白水解活性,从而遏制癌细胞生长和存活。全基因组测序、靶向深度测序显示PTEN缺陷使得蛋白酶体抑制剂对多种肿瘤治疗敏感。

 

此外,还可以利用TCGA中的特定癌种的miRNASeq数据库,比较处于不同疾病进程,不同转移状态的microRNA表达谱,挑选出合适的microRNA进行下一步研究。例如,广州医科大学附属肿瘤医院研究团队利用胃腺癌miRNASeq数据库挑选出与该癌症高度相关的miR-4521。后续利用qRT-PCR和原位杂交方法检测发现:与癌旁正常组织相比,胃癌组织miR-4521表达下调,且其下调与晚期临床阶段,转移状态及患者预后不良呈正相关。

 

在癌症治疗中,免疫检查点抑制剂(ICIs)显示出良好的抗肿瘤活性。此类药物是通过抑制ICIs 的抑制性信号,促进免疫系统抗肿瘤活性来发挥作用的。然而,目前针对ICIs的临床前研究依赖于模式动物对人免疫系统的重构。因此,使用传统的小鼠实验模型很难测试它们的有效性。例如,同源移植小鼠模型(Syngeneic model) 因其生物学和免疫系统缺乏类似于人类的微环境,其在肿瘤免疫领域的应用相对受限。又例如,肿瘤患者来源的异种移植(PDX)模型是一种将患者新鲜肿瘤组织移植于免疫缺陷小鼠建立的患者来源异种移植模型,虽然该模型较好地保留了原代肿瘤的分化程度、分子生物学基本特性和肿瘤微环境,但是由于缺乏完整的免疫系统,该模型无法用于免疫调节药物的相关研究。

 

CD34+HSC衍生的人源化小鼠是一种将人造血干细胞(hematopoietic stem cell, HSC)移植到免疫缺陷小鼠中构建的免疫系统人源化小鼠模型。该小鼠模型的免疫系统经过造血干细胞多谱系分化,能够相对完善的在小鼠体内重构人免疫系统,可以作为研究ICIs药物肿瘤免疫功能的模式动物,因此成为免疫肿瘤学临床前研究中应用最广泛的模型。

 

人源化小鼠模型的构建如图1所示:注射HSC前,这些小鼠接受亚致死性全身辐照,这会导致小鼠自体骨髓消融,从而促进人类免疫细胞的循环和定植。造血干细胞HSC能够进行多谱系分化为淋系细胞,髓系细胞(例如BRGSF-HIS小鼠)等。另外,这些人源免疫细胞会对小鼠免疫系统产生免疫耐受,通常不会发生移植物抗宿主病(GVHD),因此寿命更长。但是,该模型也有一个缺陷:缺乏供人源T细胞发育成熟的人胸腺,T淋巴细胞功能减弱。

HSC人源化小鼠

图1:HSC人源化小鼠模型构建流程

 HSC人源化小鼠

图2. 将人CD34+造血干细胞移植到BRGSF重度免疫缺陷小鼠体内进行人免疫系统重建(BRGSF-HIS小鼠)。在5~7天的新生BRGSF重度免疫缺陷小鼠中移植人CD34+造血干细胞(6个donor, n=83),移植后第13周检测小鼠外周血中各类人源免疫细胞的比例。

 

HSC在其体内分化为髓系细胞的小鼠模型称之为huHSC-BRGSF (BRGSF-HIS)小鼠。该模型可用于研究肿瘤发生过程中髓系细胞的作用。某些癌症抗原依赖于髓系细胞的递呈,因此也需要用到此类小鼠模型进行药效验证。此外,该小鼠模型还可以用于造血发生、血液病、传染病(e.g. HIV/AIDS)、基因治疗等领域的长期研究。与一些其他的HSC人源化模型相比,BRGSF-HIS小鼠不仅支持人源淋系细胞的分化,也支持人源髓系细胞的分化,且人源细胞长效存在(>1年),无贫血现象,实验窗口期长。

 

BRGSF-HIS构建是指将人造血干细胞移植到经亚致死剂量辐照清髓后的BRGSF重度免疫缺陷小鼠中构建的免疫系统人源化小鼠模型。 BRGSF小鼠全称为BALB/c Rag2-/-Il2rg-/-SirpαNODFlk2-/-小鼠。“B”显示BRGSF小鼠为BALB/c遗传背景。与NOD背景小鼠不同,BALB/c背景小鼠拥有完整的补体级联反应,可用于研发利用CDC机制清除CAR-T细胞的药物。“R”表示BRGSF小鼠的Rag2基因被敲除。“G”表示BRGSF小鼠的Il2rg基因被敲除,其敲除导致小鼠NK细胞发育严重受损。“S”显示BRGSF小鼠的Sirpα (Signal-regulatory protein α) 来源于NOD遗传背景。但由于NOD背景小鼠的Sirpα与人的Sirpα结构相近,可结合人源CD47,因此SirpαNOD可抑制小鼠巨噬细胞对人源细胞的吞噬作用,提高移植率。“F”表示小鼠的Flk2基因被敲除。敲除Flk2导致小鼠髓系细胞组分发育受损,数量大幅减少。

 

Julie Lang等人(1)利用CU-ACC2病人脐带血构建的BALB/c-Rag2-Il2rγ-SirpaNOD 探讨抗PD1单抗免疫治疗对肾上腺皮质癌(ACC)免疫环境改变的影响。该小鼠模型的构建流程如下图所示:新生BRGS小鼠在注射体外培养的脐血(CB )CD34+造血干细胞之前接受辐射。在10、15和19周时确认血液中存在人髓系细胞,根据细胞种类将小鼠随机分组,并植入已在裸鼠体内发育和传代的CU-ACC2 PDX组织。一旦肿瘤达到150至300 mm3,就开始使用PD1单抗治疗。当肿瘤体积接近2000 mm3时,处死小鼠,切除肿瘤和淋巴器官,并通过流式细胞术和免疫组织化学评估免疫参数。

  HSC人源化小鼠

图3: 在hu-CB BRGS小鼠CU-ACC2-M2B PDX模型上验证PD1单抗的抗肿瘤效果

 

与对照组相比,PD1单抗治疗小鼠肿瘤生长呈现显著的抑制(60%),这与肿瘤浸润淋巴细胞活性增加、人CD8+T细胞(P<0.05)、HLA-DR+T细胞(P<0.05)以及颗粒酶B+CD8+T细胞(<0.001)增加有关。同时,对患有进展性CU-ACC2患者的治疗显示疾病得到部分缓解,病变 部位的大小减少79%至100%,并且没有发现新的转移部位。对患者转移性肝病变切片的免疫组化显示肿瘤内有大量CD8+T细胞。该研究证明BALB/c-Rag2-Il2rγ-SirpaNOD模型可能有助于定义免疫治疗反应和耐药性的机制和生物标志物,最终为ACC患者提供更个性化的护理。

HSC人源化小鼠

图4:hu-CB BRGS小鼠CU-ACC2-M2B PDX模型在接受抗PD-1治疗后,肿瘤和肿瘤间质中激活的免疫细胞增加

 

结语:免疫检查点抑制剂的出现使得多种易复发,致死率高的癌症病人生存率得到显著提高。然后,针对此类药物的研究依赖于能够重现人免疫系统的动物模型。huHSC-BRGSF (BRGSF-HIS)小鼠能够较好地重构人类免疫系统,尤其能够重构髓系细胞的发育。这使得该模型能够用于免疫治疗药物例如PD1单抗的药效验证。除肿瘤免疫研究之外,利用该类动物模型,还可以进行自身免疫疾病研究,血液病,传染病等免疫系统疾病研究。

(1) Development of an Adrenocortical Cancer Humanized Mouse Model to Characterize Anti-PD1 Effects on Tumor Microenvironment

(2) PTEN status determines chemosensitivity to proteasome inhibition in cholangiocarcinoma. Sci Transl Med. 2020 Sep 23;12(562):eaay0152.

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