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CAR-T细胞疗法在实体瘤研究中面临的挑战
嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞是经过基因工程改造的 T 细胞，可表达用于识别特定肿瘤标志物的受体，从而实现对血液肿瘤的治疗。目前全球已有7种获批上市的CAR-T细胞疗法，适应症均为血液瘤，且有多项CAR-T疗法的临床试验正在进行。然而，CAR-T细胞疗法仍存在重大的局限性，包括威胁生命的细胞因子风暴（CRS）、神经毒性、 抗原逃逸、治疗效果的持久性等，特别对于实体瘤的治疗，由于肿瘤微环境等因素的影响，目前在临床上还未取得突破性成功。本文就CAR-T细胞疗法在实体瘤治疗中存在的挑战和进展进行讨论。
图1. CAR-T细胞疗法的局限性[1]。A. 抗原逃逸；B. 脱靶效应；C. CAR-T细胞转运及浸润；D. 免疫抑制微环境；E. CAR-T细胞相关的毒性。
CAR分子结构
CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞的原理是：1.CAR分子的胞外抗原结合域特异性识别肿瘤抗原；2.识别信号传导至CAR分子的胞内结构域；3.胞内结构域活化T细胞，使细胞增殖、合成穿孔素和颗粒酶、释放细胞因子等，杀伤肿瘤细胞。为了最大程度地发挥以上功能，CAR分子的结构设计是至关重要的。
CAR分子由4个主要成分构成：
1. 细胞外抗原结合结构域：赋予CAR分子靶点特异性的功能。它的原理是将抗体的可变重链（VH）和可变轻链（VL）连接形成单链可变区段（scFv），用以特异性识别肿瘤表面抗原。
2. 铰链区：连接跨膜域和细胞外单元的结构区。铰链的作用是提供空间灵活性，可以克服空间位阻，并且拥有合适的长度允许抗原结合域接近目标表位[1]。
3. 跨膜结构域：主要功能是将CAR分子锚定在T细胞的细胞膜上。有研究表明，跨膜区可能影响CAR分子的表达水平、稳定性，在信号传导中发挥作用[2][3][4]。
4. 细胞内信号传导结构域：CAR分子共刺激的效果是CAR工程中备受关注的焦点。1-3代CAR分子的主要区别来自于胞内的共刺激结构域。两种最常见的、经由FDA批准的共刺激域CD28和4-1BB都具有高效的活化T细胞的效果，可诱导T细胞执行不同的功能[5]。
图2. CAR分子设计蓝图[20]。
CAR-T细胞治疗实体瘤的挑战
1●肿瘤抗原异质性
肿瘤抗原异质性是CAR-T细胞疗法对抗实体瘤的障碍之一。肿瘤抗原主要分为两种：肿瘤相关抗原（TAA）和肿瘤特异性抗原（TSA）：TAA在肿瘤细胞中高表达，在正常组织细胞中也有表达，但表达量较低；TSA仅在肿瘤细胞中表达，不在正常组织细胞中表达，因此也是最理想的抗原靶点。由于TSA的发现和筛选极为困难，CAR分子最常用的识别靶点是TAA，因此不同类型肿瘤细胞对于TAA的多样性表达可能会影响CAR-T细胞对癌细胞的识别，并降低CAR-T治疗的效果。
目前已经有多种方法使CAR-T细胞靶向识别多种肿瘤相关抗原，例如在单一的T细胞上共表达多种CAR分子、可编程式的CAR表达调控等。表达两个或多个抗原识别结构域，可以使单个CAR-T细胞识别肿瘤细胞上表达的多个抗原，从而消除抗原异质性带来的不利影响。
图3. 实体瘤中的免疫抑制微环境[13]。a. 效应细胞和靶细胞；b. 免疫抑制细胞和细胞因子；c. 物理屏障；d. 肿瘤内部微环境；e. 其他免疫抑制因素
2●CAR-T细胞的回输和对肿瘤组织的浸润
CAR-T细胞可以存在于血液和淋巴系统中，因此对于血液瘤，CAR-T细胞具有更多的机会和血液肿瘤细胞接触[1]，而在实体瘤中，CAR-T细胞较难通过血液系统穿透肿瘤组织[6]。此外，由于缺乏参与T细胞渗透到肿瘤组织中的趋化因子表达，以及实体瘤中存在致密的纤维化基质，导致CAR-T细胞迁移和侵入肿瘤细胞的能力降低[7]。
在很多报道中已有将CAR-T细胞直接局部注入到肿瘤位点（Tumor site）中的方法，比如脑部[8]、乳腺[9]、胸膜[10]、肝脏等[11]。CAR-T细胞的局部注射也可能降低脱靶效应带来的风险。然而，许多实体瘤具有转移性，是局部注射CAR-T细胞的一大难点。另一方面，一些临床研究中使用趋化因子介导CAR-T细胞的运输，增强对肿瘤的定位。例如巨噬细胞集落刺激因子1受体 (CSF-1R) 在CAR-T 细胞中的表达使这些细胞对CSF-1（一种在许多实体瘤中富集的单核细胞趋化因子）产生反应，在增强CAR-T细胞增殖信号传导的同时，不影响细胞的杀伤毒性[12]。
实体瘤的肿瘤微环境在促进肿瘤生长和增殖的同时，对CAR-T细胞造成了免疫抑制。包括免疫抑制细胞如调节性T细胞（Treg）、髓源抑制细胞（MDSC）、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）[13]，实体瘤中产生的生长因子、局部细胞因子，CTLA-4和PD-1等免疫检查点分子等，这些复合环境下的肿瘤微环境会极大地限制CAR-T细胞的疗效。
在Burga等人的研究中[14]，使用基因工程产生的Gr-1抗体耗竭髓源抑制细胞（MDSC）在小鼠实验中提高了CAR-T的肿瘤杀伤效果。也有报道通过构建分泌ECM降解酶的CAR-T细胞来打破实体瘤中的物理屏障[15]。
CAR-T细胞治疗实体瘤的进展
近年来，针对实体瘤靶点的研究开始逐渐增多，已有相当一部分的研究进入到了临床Ⅱ期阶段。表1列举了一些常见的实体瘤靶点以及适应症。
表1. 实体瘤常见靶点及适应症（临床数据来源于ClinicalTrails.org）。
已有报道称，卵巢癌表面高表达的肿瘤相关糖蛋白72（TAG72）被用作 CAR-T 细胞治疗的靶点[16]。该研究构建了第二代TAG72-BBζ CAR分子，结果显示CAR-T细胞经局部腹膜内递送表现出有效的抗肿瘤活性，并延长了卵巢癌腹水小鼠的生存期。也有研究表明使用MUC16或HER2构建的CAR分子具有肿瘤靶向性，抑制卵巢癌细胞的生长和增殖。间皮素（Mesothelin）是一种细胞表面糖蛋白，已被证明在多种癌症细胞中高表达。
在肝癌治疗中，CAR-T细胞疗法的研究刚刚起步。基于CAR-T细胞的癌胚抗原（CEA）、Glypican-3、粘蛋白-1等靶点的研究已经在肝癌治疗中取得了一定的效果。将 Glypican-3 (GPC3) 抗体与CAR-T疗法联合使用可能是治疗肝脏恶性肿瘤的有效方法[21]。
在肺癌的研究中，用受体酪氨酸激酶样孤儿受体1特异性(ROR1)-CAR-T细胞治疗肺癌A549细胞系，表明其具有较强的抗肿瘤活性[18]。而Srivastava及其同事在发现ROR1 CAR-T细胞浸润性较差并且功能性失调后，使用奥沙利铂/环磷酰胺（Ox/Cy ）化疗预处理，改善了CAR-T细胞向肿瘤的迁移，并且这种方案配合抗PD-L1检查点阻断剂，可以提高生存率[19]。此外，也有其他报道证实基于CAR-T细胞的间皮素 、产生促红细胞生成素的肝细胞癌A2(EphA2)，以及PSCA和mucin-1也是肺癌的理想治疗靶点。
图5. 联合Ox/Cy 化疗预处理的CAR-T细胞疗法[19]。
CAR-T细胞疗法为血液瘤患者带来了希望，尤其是在晚期恶性肿瘤中，拥有不错的前景。然而，肿瘤微环境的免疫抑制、物理屏障、抗原异质性等因素阻碍了CAR-T细胞在实体瘤中的疗效，还有待进一步突破性进展。研究者们为了应对这些挑战已经做了很多准备和具有前瞻性的工作。新颖的想法和创造性的CAR工程设计不断迭代与更新，我们也期待着针对实体瘤CAR-T治疗的完美解决方案。
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