Tnni3k基因编辑小鼠与心血管疾病【每周一鼠】

Tnni3k基因

编码835个氨基酸构成的蛋白，其蛋白分子量约为93kD。TNNI3K蛋白含有三个结构域：N端为7个锚蛋白重复序列（ANK），中间近C端为典型的丝氨酸/苏氨酸、酪氨酸激酶结构域，C末端是一富含丝氨酸的结构域。TNNI3K属于MAPKKK激酶家族，不仅可以发生自身磷酸化，而且可以将激酶通用底物髓鞘碱性蛋白磷酸化。

在胎儿6种组织、成人8种组织的Northern Blot检测结果和76种组织的多组织点阵膜杂交实验的结果显示，TNNI3K仅在成人及胎儿的心脏中表达，而在其他组织中未见表达。因此，该基因是一个心脏特异性表达的激酶基因。不仅如此，该基因还能与心肌肌钙蛋白I、心肌肌动蛋白等一系列肌小节收缩调节蛋白发生作用。心肌细胞增强因子2C是调节TNNI3K的关键因子，另外，TNNI3K活性能被抗氧化蛋白1所抑制^[1,2]。

图1. TNNI3K蛋白结构。

Tnni3k与心血管疾病

与Tnni3k相关的疾病包括扩张型心肌病、心脏肥大。与该基因相关的GO分析包括转移酶活性、磷转移酶活性和蛋白酪氨酸激酶活性^[4]。

心肌肥厚分为生理性心肌肥厚和病理性心肌肥厚，二者都表现出心脏质量的增加、心肌细胞表面积增大、心肌肌小节组装增强、蛋白合成增加。生理性的心脏生长可能由于锻炼等因素形成，表现为正常的心脏结构，正常或改善的新功能。病理性的心脏生长往往发生于疾病状况下，如长期的压力超负荷（高血压，心脏瓣膜疾病）、容量超负荷（动静脉分流）、心肌梗死或与冠心病关联的缺血、遗传突变、糖尿病等。

生理性心肌肥厚具有保护心脏的功能作用，而病理性心肌肥厚最终发展为心衰。除此之外，病理、生理性肥厚的功能特征主要包括：肌小节组装的改变、心肌纤维化的分子机制改变、心脏能量代谢的改变以及生化与分子生物学特征的改变^[1]。

Tnni3k基因编辑小鼠

心肌细胞条件性Tnni3k纯合敲除小鼠表现出对心脏缺血/再灌注损伤的降低^[5]。

研究人员使用诱导型心肌细胞特异性表达的Cre重组酶系统研究了小鼠Tnni3k基因的功能。之后，对Tnni3k条件性敲除小鼠（Tnni3k-KO）和野生型同窝小鼠进行缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）实验。24小时后，Tnni3k-KO的梗塞明显更小（图2B-C），但两组小鼠的风险区域（areas at risk, AAR） 没有明显差异（图2D）。

在I/R诱导之后，Tnni3k-KO的三种损伤标志物cTnI、心肌肌钙蛋白T和肌球蛋白轻链在血浆中的水平相较于野生型小鼠低很多。此外，在Tnni3k-KO中，磷酸化p38的含量显著降低，但磷酸化的ERK1/2、JNK和Akt的含量在两组小鼠中未发生明显改变（图2F），这表明活化的p38含量的降低对小鼠心脏具有一定的保护作用。因此，Tnni3k可以调控心肌细胞对再灌注损伤的反应^[6]。

图2. 敲除Tnni3k可减少I/R后梗死面积和p38 MAPK激活。

(B)来自Tnni3k-KO和野生型小鼠中具有代表性的埃文斯蓝和TTC染色切片（每组n=11）。 

(C)梗死面积占AAR面积的百分比。

(D)AAR面积占左心室（left ventricle, LV）面积的百分比。

(E)血浆中cTnI、血浆肌钙蛋白T（cTnT）和肌球蛋白轻链（MLC）的含量。

(F)Tnni3k-KO和野生型小鼠左心室远端的Akt、ERK1/2、JNK1/2以及p38 MAPK磷酸化状态的代表性WB实验结果（每组n=6）。灰度分析结果在WB结果的右侧。

研究人员首先构建了由α-MHC作为启动子的Tnni3k表达质粒，并注射到胚胎中进而构建转基因动物。值得注意的是，使用转基因方式构建的小鼠，不同的个体（或称为谱系）可能具有不同的基因型或表型。研究人员发现TG-H谱系的小鼠在3月龄（31.3%）和12月龄（43.1%）的时候表现出异常的心重/体重比变化（heart weight/body weight, HW/BW）。研究人员之后对这一谱系的小鼠进行了后续分析。

在3月龄时，TG-H小鼠的心脏明显大于野生型同窝小鼠（图3A）。切片结果显示转基因小鼠具有同侧心室肥大的表型，并具有腔室尺寸较小、心室壁较厚的特点（图3B）。镜下观察结果显示，在TG-H 小鼠中未观察到坏死或肌细胞紊乱的现象（图3C，上图）。Masson三色染色的结果显示TG-H转基因小鼠没有间质纤维化的发生（图3C，下图）。除此之外，研究人员通过H&E染色检测心肌细胞的横截面积，实验结果显示，TG-H谱系小鼠的心肌细胞明显更大，并且，其平均表面积比同窝对照小鼠大1.8倍（图3D）^[6]。

图3. Tnni3k过表达转基因小鼠3月龄的心脏组织学分析。

(A)完整心脏的形态学照片。

(B)H&E染色后心脏的宏观视图，结果显示TG-H小鼠同侧心室肥大。

(C)心肌细胞的组织学分析，上图是H&E染色切片，下图是三色染色切片。

(D)从H&E染色的组织切片中定量心肌细胞的横截面积。 

小结

本篇文章介绍了Tnni3k基因，该基因是一个心脏特异性的激酶，因此其主要功能也与心脏功能有关，心脏特异性敲除该基因的小鼠在经历心脏缺血/再灌注损伤后，其损伤程度相对较低，过表达该基因的小鼠会出现心脏肥大的表型。目前已经有许多Tnni3k的抑制剂，如GSK854，GSK114以及GSK329^[8]，这些抑制剂为心脏病的治疗提供了新的思路，除此之外，该基因也是一个基因治疗和基因检测的相关靶标。

参考文献：

1.王林;TNNI3K促进心肌细胞肥大、增强肌丝钙敏感度及nexilin基因调节心肌收缩性[D];北京协和医学院;2011年

2.戴洪甜. TNNI3K对心肌缺血性损伤后心肌细胞中SDF-1表达的影响及其机制研究[D]. 华中科技大学, 2019.

3.https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q59H18

4.https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=TNNI3K&keywords=TNNI3K

5.http://www.informatics.jax.org/marker/MGI:2443276

6.Vagnozzi R J ,  Gatto G J ,  Kallander L S , et al. Inhibition of the Cardiomyocyte-Specific Kinase TNNI3K Limits Oxidative Stress, Injury, and Adverse Remodeling in the Ischemic Heart[J]. Science Translational Medicine, 2013, 5(207):207ra141.

7.Wang X ,  Wang J ,  Ming S , et al. TNNI3K, a Cardiac-Specific Kinase, Promotes Physiological Cardiac Hypertrophy in Transgenic Mice[J]. Plos One, 2013, 8(3):e58570.

8.Pham C, Muñoz-Martín N, Lodder EM. The Diverse Roles of TNNI3K in Cardiac Disease and Potential for Treatment. International Journal of Molecular Sciences. 2021; 22(12):6422. https://doi.org/10.3390/ijms22126422.